免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法：直接法和間接法。直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間反應(yīng)，即可結(jié)合并顯色。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應(yīng)結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應(yīng)，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制和醫(yī)治效果評(píng)估。SERPINF1免疫檢測(cè)免...

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法：直接法和間接法。直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間反應(yīng)，即可結(jié)合并顯色。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應(yīng)結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應(yīng)，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。PDL...

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。（2）種細(xì)胞過(guò)程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過(guò)密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過(guò)程中注意避光。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時(shí)保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí)，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達(dá)調(diào)控。cyto...

注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行.DAPI復(fù)染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長(zhǎng)510-560，發(fā)射波長(zhǎng)590nm，發(fā)紅光）。兩種抗體同時(shí)孵育：由于FIT容易萃滅，...

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；孵育過(guò)程中干片；抗原熱修復(fù)過(guò)度。染色過(guò)深：一抗?jié)舛冗^(guò)高；染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透，但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，這樣可以通過(guò)通透去除一些水溶性蛋白，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào)；建議設(shè)陰性對(duì)照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；選擇醛類固定液時(shí)，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來(lái)追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。TLR4免疫組化熒光素標(biāo)記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準(zhǔn)備...

細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢？步驟：1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板），為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中，大約60-75%滿片即可，否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘，現(xiàn)用現(xiàn)配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘；5. PBS沖洗；6. 10%正常血清封閉10分鐘；7. 加入一抗，4度孵育過(guò)夜（找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來(lái)，抗體就不容易溢出），還要記住“砸片”，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻?？贵w稀釋度1：60，較常用！8. PBS沖洗4次，各5分鐘；9加入熒光二抗，室溫30分鐘。抗體稀釋度1：400，較常用...

免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過(guò)夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)...

免疫熒光間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系。CD45免疫組化IHC免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：為了保證熒光染色的正確性...

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散），固定液包括：有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇等）；交聯(lián)劑（4%PFA、10%中性福爾馬林），固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性，不過(guò)，目前甲醛用的還是較多的，但針對(duì)磷酸化的抗體，不適合用甲醛，會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中，故應(yīng)選擇冰冷的無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇，同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā)，在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久。固定時(shí)間：取決于組合塊的大小和類型，對(duì)于大多數(shù)組織，18-24h較為理想，細(xì)胞固定時(shí)間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細(xì)胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤...

免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔；18mm12孔；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過(guò)夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋...

熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長(zhǎng)為570nm，較...

通過(guò)不同顏色熒光標(biāo)記不同的靶標(biāo)，可以直觀的觀察同一樣品細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)和蛋白。熒光標(biāo)記靶標(biāo)的方法主要包括熒光染料、免疫標(biāo)記、熒光融合蛋白等——這幾種方法均可選擇性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和蛋白，讓您在成像時(shí)更輕松地進(jìn)行觀察。細(xì)胞生物學(xué)采用的很多熒光工具基本上都是熒光基團(tuán)。這些熒光基團(tuán)經(jīng)過(guò)不同的方法修飾或結(jié)合到不同的分子上，從而具備了某些的功能與特定的細(xì)胞器或蛋白結(jié)合。通過(guò)化學(xué)修飾，單個(gè)熒光基團(tuán)可以產(chǎn)生許多變體形式，且每種變體都有不同的特異性。使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見的操作步驟。S100 beta免疫抗體細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記...

免疫熒光的制作：樣品準(zhǔn)備（貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞以及組織等）：對(duì)于貼壁細(xì)胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進(jìn)行浸泡處理，然后用干凈無(wú)菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌PBS洗去殘留的乙醇。待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，操作小心，防止細(xì)胞脫片。對(duì)于懸浮細(xì)胞：有2種方法，①先在懸浮液中進(jìn)行固定步驟，然后把細(xì)胞滴加在載玻片上，干燥后細(xì)胞會(huì)緊貼在載玻片上。②先在懸浮液中進(jìn)行固定和染色步驟，離心洗脫，然后用移液管移至盒式玻片進(jìn)行后續(xù)染色步驟。對(duì)于冷凍切片：切片放置在載玻片上后，可以直接進(jìn)行固定等后續(xù)操作。對(duì)于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少，要先進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)處理。免疫熒光技術(shù)可以通過(guò)熒光信號(hào)顯示和檢查細(xì)...

熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測(cè)方法。免疫熒光測(cè)定：抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測(cè)定熒光強(qiáng)度而推算被測(cè)物濃度的檢測(cè)方法。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：直接法測(cè)抗原：基本原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。CK19免疫組化IHC熒光的產(chǎn)生：一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過(guò)剩的...

免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問(wèn)題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無(wú)放射性污染，并且大多操作簡(jiǎn)便，便于推廣。國(guó)外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問(wèn)題，熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定，與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用，可以用于檢測(cè)病原體、肉瘤標(biāo)志物等。IL-6免...

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所...

細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢？步驟：1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板），為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中，大約60-75%滿片即可，否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘，現(xiàn)用現(xiàn)配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘；5. PBS沖洗；6. 10%正常血清封閉10分鐘；7. 加入一抗，4度孵育過(guò)夜（找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來(lái)，抗體就不容易溢出），還要記住“砸片”，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻。抗體稀釋度1：60，較常用！8. PBS沖洗4次，各5分鐘；9加入熒光二抗，室溫30分鐘?？贵w稀釋度1：400，較常用...

熒光的產(chǎn)生：一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過(guò)剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點(diǎn)是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。免疫熒光技術(shù)可以用于研究?jī)?nèi)臟移植和免疫抑制。CD3免疫組化免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每...

細(xì)胞免疫熒光步驟對(duì)大家來(lái)說(shuō)一定是很陌生的，他是一種抗原抗體反應(yīng)，好像對(duì)我們來(lái)說(shuō)他顯得很遙遠(yuǎn)的樣子，因?yàn)槲覀儾⒉涣私馑茏鍪裁?，通過(guò)這種技術(shù)可以讓我們對(duì)抗原或抗體的性質(zhì)、定位一次來(lái)分析出更多的數(shù)據(jù)。細(xì)胞免疫熒光，這對(duì)很多人來(lái)說(shuō)都是一次聽說(shuō)這個(gè)東西，也不知道他對(duì)我們會(huì)有什么好處與壞處，科學(xué)研究就是這樣子的，普通老百姓是不會(huì)明白其中的道理的，但是這些研究也是確實(shí)的在我們的生活中取得了成果，能夠讓大家過(guò)的更加舒適。熒光抗體技術(shù)可以用于檢測(cè)和定位細(xì)胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。X Hu Nuclei免疫熒光IF免疫熒光通過(guò)抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量。...

免疫熒光通過(guò)抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，利用定量技術(shù)測(cè)定含量，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析。細(xì)胞免疫熒光用途：快速直觀顯示所檢測(cè)蛋白的細(xì)胞定位。材料與儀器：樣品：貼壁細(xì)胞；試劑：4% 組織固定液，PBS，Triton X-100，BSA，熒光二抗，免疫熒光染色二抗稀釋液，抗熒光猝滅封片液，0.25% 胰酶；器材：6/12/24 孔板，細(xì)胞爬片（蓋玻片），載玻片，15 ml 離心管。免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達(dá)...

熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測(cè)方法。免疫熒光測(cè)定：抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測(cè)定熒光強(qiáng)度而推算被測(cè)物濃度的檢測(cè)方法。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：直接法測(cè)抗原：基本原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病。Brdu免疫熒光試驗(yàn)細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗，37℃...

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。（2）種細(xì)胞過(guò)程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過(guò)密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過(guò)程中注意避光。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅。或者放于暗盒內(nèi)，暫時(shí)保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí)，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。熒光抗體技術(shù)可以用于檢測(cè)和定位細(xì)胞或組織中的特定抗原物質(zhì)...

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：根據(jù)所檢測(cè)抗原所在位置來(lái)確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測(cè)抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間，1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無(wú)/弱染色：烤片溫度過(guò)高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過(guò)低，孵育是否時(shí)間過(guò)短等。免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。CD11B免疫熒光IF免疫熒光通透（目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)），0....

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法：直接法和間接法。直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間反應(yīng)，即可結(jié)合并顯色。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應(yīng)結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應(yīng)，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景。細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)熒光色素：四甲基...

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使熒光減弱。2）每次試驗(yàn)時(shí)，需設(shè)置以下三種對(duì)照：①陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤(rùn)，避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答。MEL-1A-R免疫熒光試驗(yàn)熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyana...

細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實(shí)現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量，首先應(yīng)建立針對(duì)目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究，同時(shí)將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部，標(biāo)記目的靶點(diǎn)。封閉細(xì)胞樣品，防止熒光標(biāo)記物與研究無(wú)關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用。ALBUMIN免疫熒光IF細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：根據(jù)所檢測(cè)抗原所在位置來(lái)確認(rèn)是否需要加入...

基于熒光成像的技術(shù)對(duì)于查詢細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用。當(dāng)與免疫化學(xué)結(jié)合時(shí)，熒光成像技術(shù)的分析能力增加，增強(qiáng)了這種技術(shù)在普遍的研究和臨床應(yīng)用中的實(shí)用性，使其成為寶貴的工具。免疫熒光顯微鏡通過(guò)使活細(xì)胞成像能夠可視化整個(gè)細(xì)胞器，徹底改變了細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進(jìn)行細(xì)胞分析的常用熒光成像技術(shù)。免疫熒光（IF）是一種強(qiáng)大的免疫染色技術(shù)，利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標(biāo)分子結(jié)合的熒光素標(biāo)記抗體。免疫熒光用于鑒定細(xì)胞中的細(xì)胞和組織特異性抗原；可視化蛋白質(zhì)的存在與否、細(xì)胞定位和活化狀態(tài)；并分析免疫反應(yīng)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。BAX免疫細(xì)...

免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過(guò)夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)...

熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點(diǎn)：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體，因此物種交叉反應(yīng)性問(wèn)題增加；與直接免疫熒光相比，時(shí)間更長(zhǎng)（操作步驟更多）。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大；與直接免疫熒光相比，通過(guò)信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度；熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點(diǎn)：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體，因此物種交叉反應(yīng)性問(wèn)題增加；與直接免疫熒光相比，時(shí)間更長(zhǎng)（操作步驟更多）。熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來(lái)追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。F4/80免疫熒光的產(chǎn)生...

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗，37℃，室溫避光孵育1小時(shí)。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記，因此操作過(guò)程盡量在暗處進(jìn)行。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核，一般為藍(lán)色熒光；避光孵育5-10min。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，可將注射器針頭針尖向背面做個(gè)小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，注意將爬片反過(guò)來(lái)貼于多聚賴氨酸載...