MEL-1A-R免疫熒光試驗(yàn)

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2023-09-03

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1)熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,或于4℃保存4h,時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)使熒光減弱。2)每次試驗(yàn)時(shí),需設(shè)置以下三種對(duì)照:①陽(yáng)性對(duì)照:陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對(duì)照:陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對(duì)照:PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中,始終保持濕潤(rùn),避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物,應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色。免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答。MEL-1A-R免疫熒光試驗(yàn)

MEL-1A-R免疫熒光試驗(yàn),免疫

熒光色素:四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)結(jié)構(gòu)式如下:較大吸引光波長(zhǎng)為550nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。MEL-1A-R免疫熒光試驗(yàn)免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和信號(hào)通路。

MEL-1A-R免疫熒光試驗(yàn),免疫

免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是:特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是:非特異性染色問(wèn)題尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性不足,技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同,還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比,熒光免疫法無(wú)放射性污染,并且大多操作簡(jiǎn)便,便于推廣。國(guó)外生產(chǎn)的TDM用試劑盒,有相當(dāng)一部分即屬于此類,并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問(wèn)題,熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定,與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣,在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。

免疫熒光的制作:樣品準(zhǔn)備(貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞以及組織等):對(duì)于貼壁細(xì)胞:先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進(jìn)行浸泡處理,然后用干凈無(wú)菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中,用無(wú)菌PBS洗去殘留的乙醇。待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片,操作小心,防止細(xì)胞脫片。對(duì)于懸浮細(xì)胞:有2種方法,①先在懸浮液中進(jìn)行固定步驟,然后把細(xì)胞滴加在載玻片上,干燥后細(xì)胞會(huì)緊貼在載玻片上。②先在懸浮液中進(jìn)行固定和染色步驟,離心洗脫,然后用移液管移至盒式玻片進(jìn)行后續(xù)染色步驟。對(duì)于冷凍切片:切片放置在載玻片上后,可以直接進(jìn)行固定等后續(xù)操作。對(duì)于石蠟切片:免疫熒光中石蠟切片較少,要先進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)處理。免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點(diǎn)和作用機(jī)制。

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免疫熒光的原理:免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí),只要知道其中的一個(gè)因素,就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體,直接加在抗原標(biāo)本上,經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色,用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體,室溫下干燥后封片、鏡檢。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常。MEL-1A-R免疫熒光試驗(yàn)

免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原的技術(shù)。MEL-1A-R免疫熒光試驗(yàn)

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致:1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,PBS洗三遍。注意:有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小,因此夾取的時(shí)候要小心,注意 反正面,放在皿里洗比較方便,避免了來(lái)回夾取,另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖,不要細(xì)胞沖下來(lái)。洗的時(shí)候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉,沒有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘,PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過(guò)夜,也可37度2小時(shí),感覺前者效果好,PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光),或者37度1半小時(shí),PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核,然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒?huì)干,所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。MEL-1A-R免疫熒光試驗(yàn)

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