細胞免疫熒光步驟是什么呢？步驟：1. 細胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板），為后面照像打基礎。細胞密度適中，大約60-75%滿片即可，否則容易脫片。2. 取出細胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘，現(xiàn)用現(xiàn)配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘；5. PBS沖洗；6. 10%正常血清封閉10分鐘；7. 加入一抗，4度孵育過夜（找個小瓶蓋將小玻片支起來，抗體就不容易溢出），還要記住“砸片”，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻?？贵w稀釋度1：60，較常用！8. PBS沖洗4次，各5分鐘；9加入熒光二抗，室溫30分鐘?？贵w稀釋度1：400，較常用...

細胞免疫熒光：細胞種板與細胞爬片制備：1) 細胞密度在90%-95%左右，用預熱胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養(yǎng)基中，充分吹打，使之成單細胞懸液，計數(shù)。2)取細胞培養(yǎng)12孔板，在每個孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小，先在每個孔里準備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基，然后將爬片置于液滴上，壓緊，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，防止加細胞懸液時爬片漂起，造成雙層細胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi)。3)24h或者48h后，根據(jù)細胞生長速度快慢，觀察判斷細胞密度，約90%時進行細胞免疫熒光。免疫熒光技術可以用于研究內(nèi)臟移植和免疫抑制。LY6G免疫熒光分析免疫熒光間接法測抗體實驗...

細胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細胞爬片時，動作應輕柔，防止將細胞爬片夾碎，影響實驗進程。（2）種細胞過程中，要注意將細胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細胞局部生長過密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細胞爬片進行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。免疫熒光技術可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常。CD31免...

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計...

免疫熒光通透（目的是使抗體進入胞內(nèi)），0.5%TritonX-100(一種去垢劑，用PBS配制)室溫通透20min（針對胞內(nèi)抗原，若是細胞膜上表達的抗原則省略該步驟）；除了TritonX-100，也可作為通透劑，并且固定后的樣品不需要通透。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點進行結合），通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。醛類固定的樣品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進行封閉。免疫...

免疫熒光應用范圍：其應用范圍極其普遍，可以測定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì)、細胞因子、細胞表面抗原、多肽、核酸、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、肉瘤標志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、藥物檢測、免疫學、血型鑒定等。免疫熒光實驗步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次。封閉：使用封閉液對樣本進行封閉，一般1h。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。加二抗：使用間接法時需要加二抗處理，根據(jù)說明書使用合適的濃度，避光處理1h（后面步驟均需避光）。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。封片：滴一滴防淬滅劑，封片。可立即觀察后暫存4℃盡快觀察。免...

細胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細胞 3 次，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml，進行細胞固定，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min，目的是使細胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可...

細胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細胞爬片時，動作應輕柔，防止將細胞爬片夾碎，影響實驗進程。（2）種細胞過程中，要注意將細胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細胞局部生長過密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細胞爬片進行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅。或者放于暗盒內(nèi)，暫時保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。免疫熒光技術可以用于研究細胞凋亡和細胞存活。組織免疫熒光...

細胞免疫熒光實驗常見問題:1、信號弱或者無信號：細胞或組織樣本保存時間過長；2）抗體濃度不合適，參照抗體說明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達量進行摸索；3）一抗孵育時間不合適，建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景：封閉不充分；抗體濃度過高；抗體孵育時間過長或溫度過高；清洗不充分；樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復也可以幫助解決非特異性染色；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。免疫熒光技術是一種利用熒光物質(zhì)標記抗...

細胞免疫熒光實驗注意事項：根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認是否需要加入 Triton 進行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達到效果；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光。縮短在熒光顯微鏡下的觀察時間，1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色：烤片溫度過高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過低，孵育是否時間過短等。免疫熒光技術可以用于研究細胞凋亡、細胞增殖和細胞分化等生物學過程。AIRE-1免疫熒光分析免疫熒光的制作：樣品準備（貼壁細胞、懸浮細胞...

免疫熒光實驗的注意事項：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標本自發(fā)熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。③陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標本較好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。免疫熒光技術利用熒光染料標記的抗體與目標分子結合，從而實現(xiàn)可視化檢...

免疫熒光技術又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。Coons等于1941年初次采用熒光素進行標記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，該技術已相當成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術。在實際工作中熒光抗原技術很少應用，所...

免疫熒光的制作：樣品準備（貼壁細胞、懸浮細胞以及組織等）：對于貼壁細胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進行浸泡處理，然后用干凈無菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中，用無菌PBS洗去殘留的乙醇。待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，操作小心，防止細胞脫片。對于懸浮細胞：有2種方法，①先在懸浮液中進行固定步驟，然后把細胞滴加在載玻片上，干燥后細胞會緊貼在載玻片上。②先在懸浮液中進行固定和染色步驟，離心洗脫，然后用移液管移至盒式玻片進行后續(xù)染色步驟。對于冷凍切片：切片放置在載玻片上后，可以直接進行固定等后續(xù)操作。對于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少，要先進行脫蠟和抗原修復處理。免疫熒光技術在生物醫(yī)學研究中具有普遍的應...

細胞免疫熒光步驟是什么呢？步驟：1. 細胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板），為后面照像打基礎。細胞密度適中，大約60-75%滿片即可，否則容易脫片。2. 取出細胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘，現(xiàn)用現(xiàn)配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘；5. PBS沖洗；6. 10%正常血清封閉10分鐘；7. 加入一抗，4度孵育過夜（找個小瓶蓋將小玻片支起來，抗體就不容易溢出），還要記住“砸片”，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻。抗體稀釋度1：60，較常用！8. PBS沖洗4次，各5分鐘；9加入熒光二抗，室溫30分鐘。抗體稀釋度1：400，較常用...

熒光抗體技術：抗原抗體反應后，利用熒光顯微鏡判定結果的檢測方法。免疫熒光測定：抗原抗體反應后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法。免疫熒光實驗步驟：直接法測抗原：基本原理：將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。免疫熒光技術可以用于研究病毒傳播和免疫應答。P21免疫熒光分析免疫熒光的原理：免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發(fā)生反應時，只要知道其...

免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進行的定性測定相反）；復用能力（可以結合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應抗原（或抗體）。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術測定含量。免疫熒光技術可以用于研究植物病理學和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。...

熒光的產(chǎn)生：一此化學物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學應所引起的稱為化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術一般應用致熒光物質(zhì)進行標記。免疫熒光技術通過熒光信號的觀察來確定抗原或抗體的分布和定位。ucp2免疫熒光細胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細胞 3 ...

免疫熒光技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜。熒光免疫法按反應體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術用于定量測定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應用。免疫熒光技術利用熒光染料標記的抗體與目標分子結合，從而實現(xiàn)可視化檢測。CD16...

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490--495nm，較大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結構式如下：有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易...