PD-L1免疫熒光染色

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2023-07-07

其他熒光物質(zhì):1.酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng),一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,后者可發(fā)出熒光,激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等。2.鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪(Eu3+)、鋱(Tb3+)、鈰(Ce3+)等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬,發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄,熒光衰變時(shí)間長(zhǎng),較適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。所需要的儀器:熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀和時(shí)間分辨熒光計(jì)等儀器激光共聚焦顯微鏡。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。PD-L1免疫熒光染色

PD-L1免疫熒光染色,免疫

細(xì)胞的固定及免疫熒光:吸去一抗,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,37℃,室溫避光孵育1小時(shí)。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記,因此操作過(guò)程盡量在暗處進(jìn)行。吸去二抗,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。向玻片上滴加DAPI,或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核,一般為藍(lán)色熒光;避光孵育5-10min。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次,每次 5 min,洗去多余的DAPI。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,張力較大,可將注射器針頭針尖向背面做個(gè)小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,注意將爬片反過(guò)來(lái)貼于多聚賴氨酸載玻片上,然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,注意選擇抗體對(duì)應(yīng)的激發(fā)光源。CD86免疫熒光免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。

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免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟:1.樣本準(zhǔn)備:細(xì)胞或薄組織。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞,在傳代培養(yǎng)時(shí),將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定:取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖尽R话阌?%PFA固定4℃過(guò)夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。3.洗滌:PBS洗滌5min*3次。4.打孔:選擇合適的通透劑處理樣本,目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。

細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,以及一些特殊信號(hào)分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過(guò)程中,需要用到細(xì)胞爬片,通過(guò)將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),細(xì)胞在爬片上生長(zhǎng),進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn):通過(guò)增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大;與直接免疫熒光相比,通過(guò)信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究?jī)?nèi)臟移植和免疫抑制。

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熒光素標(biāo)記抗體的方法:方法及步驟:①抗體的準(zhǔn)備:取適量已知球蛋白濃度之溶液,置入三角燒瓶中,加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,使然后蛋白濃度為20mg/ml,緩沖液容量為總量的1/10,混勻,將三角燒瓶置冰槽中,電磁攪拌(速度適當(dāng)以不起泡沫為宜)5~10min。②熒光素的準(zhǔn)備:根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量,按每毫克蛋白加0.01mg熒光素,用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結(jié)合(或稱標(biāo)記):邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上(大約5~10min內(nèi)加完),加畢后,繼續(xù)攪拌12~18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,故須及時(shí)添冰去水;亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫(kù)中。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期。Brdu免疫

在1941年,Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。PD-L1免疫熒光染色

熒光的猝滅:熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅,這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài),所吸收的能量無(wú)法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑,以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光(特別是紫外光)的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅。伊文思藍(lán)或低濃度的過(guò)錳酸鉀、碘溶液等對(duì)標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染,以減弱非特異性熒光本質(zhì),使特異熒光更突出顯示。PD-L1免疫熒光染色

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