細胞免疫熒光步驟是什么呢?步驟:1. 細胞一定要貼在玻片上(較好可以放入24孔板),為后面照像打基礎(chǔ)。細胞密度適中,大約60-75%滿片即可,否則容易脫片。2. 取出細胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,現(xiàn)用現(xiàn)配。(以下各步驟切毋使玻片干燥)3. PBS沖洗;4. 0.1%Triton作用20分鐘;5. PBS沖洗;6. 10%正常血清封閉10分鐘;7. 加入一抗,4度孵育過夜(找個小瓶蓋將小玻片支起來,抗體就不容易溢出),還要記住“砸片”,就是抗體從較高處落到片子上,以分布均勻。抗體稀釋度1:60,較常用!8. PBS沖洗4次,各5分鐘;9加入熒光二抗,室溫30分鐘??贵w稀釋度1:400,較常用!10. 90%甘油封片。也很關(guān)鍵阿,多封幾次才有體會。12. 避光保存,或到顯微鏡下觀察。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達的標(biāo)記免疫技術(shù)。VEGFR2免疫熒光試驗
細胞免疫熒光實驗常見問題:1、信號弱或者無信號:細胞或組織樣本保存時間過長;2)抗體濃度不合適,參照抗體說明書的稀釋濃度,再根據(jù)樣本表達量進行摸索;3)一抗孵育時間不合適,建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景:封閉不充分;抗體濃度過高;抗體孵育時間過長或溫度過高;清洗不充分;樣本變干,染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多:固定液殘留,這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸,并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色;二抗殘留,二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,只要熒光顯微鏡的強度還可以增大,那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。CD42b免疫組化免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位和表達水平。
免疫熒光應(yīng)用范圍:其應(yīng)用范圍極其普遍,可以測定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì)、細胞因子、細胞表面抗原、多肽、核酸、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類別,又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、藥物檢測、免疫學(xué)、血型鑒定等。免疫熒光實驗步驟:洗滌:PBS洗滌5min*3次。封閉:使用封閉液對樣本進行封閉,一般1h。加一抗:使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜。洗滌:PBS或PBST洗滌5min*3次。加二抗:使用間接法時需要加二抗處理,根據(jù)說明書使用合適的濃度,避光處理1h(后面步驟均需避光)。洗滌:PBS或PBST洗滌5min*3次。封片:滴一滴防淬滅劑,封片??闪⒓从^察后暫存4℃盡快觀察。
細胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),細胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后,采用熒光標(biāo)記,標(biāo)記完成后,顯微鏡下觀察細胞內(nèi)某種抗原成分的多少,從而做出一個定位研究,也可以為細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)提供一個明確的指導(dǎo),細胞免疫熒光具有敏感性強、特異性高、速度快的特點,是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù),也是比較精確的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗結(jié)合,其次是帶有熒光基團的二抗識別并結(jié)合一抗,熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。免疫熒光技術(shù)通過熒光信號的觀察來確定抗原或抗體的分布和定位。
免疫熒光技術(shù)的主要特點是:特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是:非特異性染色問題尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性不足,技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同,還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比,熒光免疫法無放射性污染,并且大多操作簡便,便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒,有相當(dāng)一部分即屬于此類,并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測定中的本底較高等問題,熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定,與酶免疫測定和放射免疫分析一樣,在臨床檢驗中應(yīng)用。免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景。VEGFR2免疫熒光試驗
免疫熒光技術(shù)中,以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù)。VEGFR2免疫熒光試驗
細胞免疫熒光簡單實驗步驟如下:1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈:3min×3。4. 1%Triton:25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈:2×5 min。6. 羊血清封閉:37度,20分鐘。7. 一抗,4度過夜,一般要大于18小時或者37度,1-2小時。8. 4度PBS洗凈,3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈,3×5 min。11. 涼干封片(封閉液PH8.5);不管采用何種方法,在使用PBS緩沖液漂洗時,都要漂洗干凈并且要測下pH值,可以使用PBS多清洗幾次,也可以延長PBS清洗時間,如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。VEGFR2免疫熒光試驗
上海睿寶和生物科技有限公司位于上海市閔行區(qū)都莊路2350號2幢201室,交通便利,環(huán)境優(yōu)美,是一家服務(wù)型企業(yè)。是一家私營有限責(zé)任公司企業(yè),隨著市場的發(fā)展和生產(chǎn)的需求,與多家企業(yè)合作研究,在原有產(chǎn)品的基礎(chǔ)上經(jīng)過不斷改進,追求新型,在強化內(nèi)部管理,完善結(jié)構(gòu)調(diào)整的同時,良好的質(zhì)量、合理的價格、完善的服務(wù),在業(yè)界受到寬泛好評。公司業(yè)務(wù)涵蓋病理檢測服務(wù),免疫組化檢測服務(wù),分子檢測服務(wù),全景掃描服務(wù),價格合理,品質(zhì)有保證,深受廣大客戶的歡迎。睿寶和生物將以真誠的服務(wù)、創(chuàng)新的理念、***的產(chǎn)品,為彼此贏得全新的未來!