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細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題:1、信號(hào)弱或者無(wú)信號(hào):細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng);2)抗體濃度不合適,參照抗體說(shuō)明書(shū)的稀釋濃度,再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索;3)一抗孵育時(shí)間不合適,建議 4 ℃ 過(guò)夜孵育。2、高背景:封閉不充分;抗體濃度過(guò)高;抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高;清洗不充分;樣本變干,染色過(guò)程確保樣品始終浸沒(méi)于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多:固定液殘留,這里需要縮短固定時(shí)間并且在封閉液中加甘氨酸,并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色;二抗殘留,二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大,那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原的技術(shù)。IL-6免疫熒光染色
免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1)熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,或于4℃保存4h,時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)使熒光減弱。2)每次試驗(yàn)時(shí),需設(shè)置以下三種對(duì)照:①陽(yáng)性對(duì)照:陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對(duì)照:陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對(duì)照:PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中,始終保持濕潤(rùn),避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物,應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色。ALBUMIN免疫熒光分析免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用。
免疫熒光間接法:如檢查未知抗原,先用已知未標(biāo)記的特異抗體(一抗體)與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng),用水洗去未反應(yīng)的抗體,再用標(biāo)記的抗抗體(第二抗體)與抗原標(biāo)本反應(yīng),使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物,再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體,干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體,則表明抗原標(biāo)本是已知的,待檢血清為一抗體,其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體,同于血清球蛋白有種的特異性,如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng),因此,制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。
細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,以及一些特殊信號(hào)分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過(guò)程中,需要用到細(xì)胞爬片,通過(guò)將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),細(xì)胞在爬片上生長(zhǎng),進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn):通過(guò)增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大;與直接免疫熒光相比,通過(guò)信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
細(xì)胞的固定及免疫熒光:1)吸除培養(yǎng)基,一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次,每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,進(jìn)行細(xì)胞固定,室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,目的是使細(xì)胞通透。5) 除去Triton X-100,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(shí)(選擇的封閉液與后面操作過(guò)程中抗體稀釋液一致)。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液,向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗(一次使用抗體可以根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)推薦濃度,后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以摸索抗體的適宜濃度),4℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術(shù)的范疇。NLRP3免疫組化IHC
在1941年,Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。IL-6免疫熒光染色
細(xì)胞的固定及免疫熒光:注意事項(xiàng):(1)取細(xì)胞爬片時(shí),動(dòng)作應(yīng)輕柔,防止將細(xì)胞爬片夾碎,影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。(2)種細(xì)胞過(guò)程中,要注意將細(xì)胞輕柔混勻,“八”字或者“十”字形搖晃,防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過(guò)密。(3)稀釋、加二抗(熒光抗體)及此后的洗滌過(guò)程中注意避光。(4)細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后,需要盡快拍照,防止免疫熒光淬滅?;蛘叻庞诎岛袃?nèi),暫時(shí)保存于4度冰箱,盡快拍照。(5)在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí),要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色,只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。IL-6免疫熒光染色
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