細(xì)胞的固定及免疫熒光:注意事項(xiàng):(1)取細(xì)胞爬片時,動作應(yīng)輕柔,防止將細(xì)胞爬片夾碎,影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。(2)種細(xì)胞過程中,要注意將細(xì)胞輕柔混勻,“八”字或者“十”字形搖晃,防止細(xì)胞局部生長過密。(3)稀釋、加二抗(熒光抗體)及此后的洗滌過程中注意避光。(4)細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后,需要盡快拍照,防止免疫熒光淬滅?;蛘叻庞诎岛袃?nèi),暫時保存于4度冰箱,盡快拍照。(5)在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時,要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色,只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常。CD31免疫熒光IF
檢測復(fù)雜的生物學(xué)結(jié)構(gòu)需要較高清晰度的熒光信號,并將熒光信號從背景噪聲中分離開來。標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光標(biāo)記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于:需要精細(xì)調(diào)整樣品信號達(dá)到峰值特異性、高清晰度和較佳放大倍數(shù)。雖然熒光基團(tuán)是進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞成像的較佳選擇,但不可避免地也極易發(fā)生光漂白,即熒光信號的光化學(xué)降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差,產(chǎn)生假性結(jié)果??勾銣绶馄瑒┛梢员Wo(hù)熒光標(biāo)記蛋白的穩(wěn)定性,維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的圖像信號完整度。IBA-1免疫檢測免疫熒光技術(shù)是基于免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的重要方法之一。
其他熒光物質(zhì):1.酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,后者可發(fā)出熒光,激發(fā)光波長為360nm,發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。2.鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪(Eu3+)、鋱(Tb3+)、鈰(Ce3+)等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,發(fā)射光波長范圍窄,熒光衰變時間長,較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器:熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀和時間分辨熒光計(jì)等儀器激光共聚焦顯微鏡。
免疫熒光固定(防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散),固定液包括:有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇等);交聯(lián)劑(4%PFA、10%中性福爾馬林),固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性,不過,目前甲醛用的還是較多的,但針對磷酸化的抗體,不適合用甲醛,會導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,故應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇,同時應(yīng)注意甲醛會揮發(fā),在4-8°C不宜儲存太久。固定時間:取決于組合塊的大小和類型,對于大多數(shù)組織,18-24h較為理想,細(xì)胞固定時間較短,一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細(xì)胞樣品為例:用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min。免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原的技術(shù)。
免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng):對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋度不應(yīng)超過1:20,抗體濃度過低,會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,影響結(jié)果的觀察。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,染色時間可以從10min到數(shù)小時,一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于37℃可加強(qiáng)染色效果,但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2℃的低溫,延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術(shù)的范疇。CD42b免疫熒光染色
免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活。CD31免疫熒光IF
細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中,需要用到細(xì)胞爬片,通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),細(xì)胞在爬片上生長,進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn):通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號放大;與直接免疫熒光相比,通過信號放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。CD31免疫熒光IF
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