細胞的固定及免疫熒光:1)吸除培養(yǎng)基,一般先加入PBS浸洗細胞 3 次,每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,進行細胞固定,室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,目的是使細胞通透。5) 除去Triton X-100,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致)。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液,向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗(一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度,后續(xù)實驗可以摸索抗體的適宜濃度),4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。免疫熒光技術是一種利用熒光物質標記抗體來定位抗原的技術。VEGFR2免疫檢測
免疫熒光-實驗步驟:細胞爬片免疫熒光:在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;(圓蓋片:13mm24孔;18mm12孔;20mm6孔)用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA(PBS配置),室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。osteocalcin(ocn)免疫熒光分析免疫熒光技術可以用于研究細胞信號傳導和信號通路。
免疫熒光固定(防止離體組織自溶抗原擴散),固定液包括:有機溶劑(甲醇、乙醇等);交聯(lián)劑(4%PFA、10%中性福爾馬林),固定液的選擇取決于被研究抗原的性質及所用抗體的特性,不過,目前甲醛用的還是較多的,但針對磷酸化的抗體,不適合用甲醛,會導致磷酸蛋白從膜表面轉移到胞漿中,故應選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇,同時應注意甲醛會揮發(fā),在4-8°C不宜儲存太久。固定時間:取決于組合塊的大小和類型,對于大多數(shù)組織,18-24h較為理想,細胞固定時間較短,一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細胞樣品為例:用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min。
免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性,所以當抗原抗體發(fā)生反應時,只要知道其中的一個因素,就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體(或抗原)上,與其相應的抗原(或抗體)結合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應。在此基礎上又分為兩種方法:直接法和間接法。直接法:將標記的特異性熒光抗體直接加到抗原上,經(jīng)過一定時間反應,即可結合并顯色。間接法:先用抗原的抗體(一抗)與抗原反應結合,再用熒光標記的二抗(一抗的抗體)與抗原反應,形成抗體-抗原-抗體復合物。在實際工作中,熒光抗原技術應用較少,因此通常將其稱為熒光抗體技術或免疫熒光技術。
熒光素標記抗體的方法:方法及步驟:①抗體的準備:取適量已知球蛋白濃度之溶液,置入三角燒瓶中,加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,使然后蛋白濃度為20mg/ml,緩沖液容量為總量的1/10,混勻,將三角燒瓶置冰槽中,電磁攪拌(速度適當以不起泡沫為宜)5~10min。②熒光素的準備:根據(jù)欲標記的蛋白質總量,按每毫克蛋白加0.01mg熒光素,用分析天平準確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結合(或稱標記):邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上(大約5~10min內(nèi)加完),加畢后,繼續(xù)攪拌12~18h。結合期間應保持蛋白溶液于4℃左右,故須及時添冰去水;亦可將結合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中。免疫熒光技術可以用于研究食品安全和生物安全。osteocalcin(ocn)免疫熒光分析
免疫熒光技術是將抗體與熒光素等示蹤物質結合,通過抗原抗體反應進行定位。VEGFR2免疫檢測
熒光色素:異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,F(xiàn)ITC)為黃色或橙黃色結晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,較大吸收光波長為490495nm,較大發(fā)射光波長520530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,結構式如下:有兩種同分異結構,其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質結合能力等方面都更好,在冷暗干燥處可保存多年,是應用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點是:①人眼對黃綠色較為敏感,②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明(rhodamine,RIB200)為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精。性質穩(wěn)定,可長期保存。結構式如下:較大吸收光波長為570nm,較大發(fā)射光波長為595~600nm,呈橘紅色熒光。VEGFR2免疫檢測
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