NF200免疫檢測(cè)

來源: 發(fā)布時(shí)間:2023-09-28

免疫熒光固定(防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散),固定液包括:有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇等);交聯(lián)劑(4%PFA、10%中性福爾馬林),固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性,不過,目前甲醛用的還是較多的,但針對(duì)磷酸化的抗體,不適合用甲醛,會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,故應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇,同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā),在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久。固定時(shí)間:取決于組合塊的大小和類型,對(duì)于大多數(shù)組織,18-24h較為理想,細(xì)胞固定時(shí)間較短,一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細(xì)胞樣品為例:用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。NF200免疫檢測(cè)

NF200免疫檢測(cè),免疫

免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是:特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是:非特異性染色問題尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性不足,技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同,還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比,熒光免疫法無放射性污染,并且大多操作簡(jiǎn)便,便于推廣。國(guó)外生產(chǎn)的TDM用試劑盒,有相當(dāng)一部分即屬于此類,并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問題,熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定,與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣,在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。NF200免疫檢測(cè)免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。

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熒光效率:熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率,與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率=發(fā)射熒光的光量分子數(shù)(熒光強(qiáng)度)/吸收光的光量子數(shù)(激發(fā)光強(qiáng)度)。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度,除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外,也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜(熒光光譜),即在某一特定波長(zhǎng)處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的較大吸收峰波長(zhǎng),且測(cè)定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時(shí),得到的熒光強(qiáng)度也較大。

細(xì)胞的固定及免疫熒光:注意事項(xiàng):(1)取細(xì)胞爬片時(shí),動(dòng)作應(yīng)輕柔,防止將細(xì)胞爬片夾碎,影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。(2)種細(xì)胞過程中,要注意將細(xì)胞輕柔混勻,“八”字或者“十”字形搖晃,防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過密。(3)稀釋、加二抗(熒光抗體)及此后的洗滌過程中注意避光。(4)細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后,需要盡快拍照,防止免疫熒光淬滅?;蛘叻庞诎岛袃?nèi),暫時(shí)保存于4度冰箱,盡快拍照。(5)在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí),要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色,只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見的操作步驟。

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細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):根據(jù)所檢測(cè)抗原所在位置來確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測(cè)抗原表位位于膜蛋白的白外段,則不需要通透;一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果;從加熒光二抗起,后面所有操作步驟盡量避光??s短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間,1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色:烤片溫度過高,推薦 56~60 ℃ 1~2 h;一抗是否適用固定液和石蠟切片,使用濃度是否過低,孵育是否時(shí)間過短等。免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),用于檢測(cè)和定位特定抗原或抗體。NF200免疫檢測(cè)

免疫熒光技術(shù)是基于免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的重要方法之一。NF200免疫檢測(cè)

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)步驟:滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片,10min后棄去,使標(biāo)本片保持一定濕度。滴加以0.01mol/L,pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫30min。取出玻片,置于玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗1-2次,然后按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸5min,不時(shí)振蕩。取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標(biāo)本干燥,滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫30min。重復(fù)操作3。取出玻片,用濾紙吸去多余水分,滴加一滴緩沖甘油,再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察,結(jié)果判定同直接法。NF200免疫檢測(cè)