免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時,只要知道其中的一個因素,就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法:直接法和間接法。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上,經(jīng)過一定時間反應(yīng),即可結(jié)合并顯色。間接法:先用抗原的抗體(一抗)與抗原反應(yīng)結(jié)合,再用熒光標(biāo)記的二抗(一抗的抗體)與抗原反應(yīng),形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。PDL-1/CD274免疫熒光染色
免疫熒光固定(防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散),固定液包括:有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇等);交聯(lián)劑(4%PFA、10%中性福爾馬林),固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性,不過,目前甲醛用的還是較多的,但針對磷酸化的抗體,不適合用甲醛,會導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,故應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇,同時應(yīng)注意甲醛會揮發(fā),在4-8°C不宜儲存太久。固定時間:取決于組合塊的大小和類型,對于大多數(shù)組織,18-24h較為理想,細(xì)胞固定時間較短,一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細(xì)胞樣品為例:用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min。CD45免疫熒光試驗(yàn)免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景。
zo-1的免疫熒光,步驟如下:1.細(xì)胞在蓋片上生長融合到95%-100%時,從孵箱中取出。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次,每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。4.1×PBS洗3次,每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘。6.1×PBS洗3次,每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘。8.加一抗(用1%BSA稀釋)放在濕盒里,4度過夜。9.1×PBS洗3次,每次10分鐘。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘,閉光。11.1×PBS洗3次,每次10分鐘。12.95%甘油封片。注:4%甲醛,0.2%Triton,5%BSA均用1×PBS稀釋。
免疫熒光注意事項(xiàng):對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置:1、內(nèi)源性組織背景對照:某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),會產(chǎn)生背景熒光,對結(jié)果產(chǎn)生影響,例如色素脂褐質(zhì)。因此在孵育一抗前,應(yīng)對樣品進(jìn)行觀察,確保抗原本身沒有信號。2、陽性對照:用確認(rèn)含有待測抗原的組織或細(xì)胞,與待測標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理,結(jié)果應(yīng)為陽性,可證明待測抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對照:與陽性對照相反,用明確不含有待測抗原的細(xì)胞或組織切片染色,結(jié)果若為陰性,可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用,幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系。
其他熒光物質(zhì):1.酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,后者可發(fā)出熒光,激發(fā)光波長為360nm,發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。2.鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪(Eu3+)、鋱(Tb3+)、鈰(Ce3+)等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,發(fā)射光波長范圍窄,熒光衰變時間長,較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器:熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀和時間分辨熒光計(jì)等儀器激光共聚焦顯微鏡。免疫熒光技術(shù)可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號,從而確定目標(biāo)分子的存在和位置。ucp2免疫熒光染色
免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活。PDL-1/CD274免疫熒光染色
細(xì)胞免疫熒光:細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備:1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右,用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中,充分吹打,使之成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板,在每個孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,然后將爬片置于液滴上,壓緊,使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,防止加細(xì)胞懸液時爬片漂起,造成雙層細(xì)胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi)。3)24h或者48h后,根據(jù)細(xì)胞生長速度快慢,觀察判斷細(xì)胞密度,約90%時進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光。PDL-1/CD274免疫熒光染色