細(xì)胞和組織樣品處理:準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品:為實現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量,首先應(yīng)建立針對目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究,同時將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定,然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部,標(biāo)記目的靶點。封閉細(xì)胞樣品,防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合,較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色。抗體能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合,而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用。ALBUMIN免疫熒光IF
細(xì)胞免疫熒光實驗注意事項:根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段,則不需要通透;一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果;從加熒光二抗起,后面所有操作步驟盡量避光??s短在熒光顯微鏡下的觀察時間,1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色:烤片溫度過高,推薦 56~60 ℃ 1~2 h;一抗是否適用固定液和石蠟切片,使用濃度是否過低,孵育是否時間過短等。GFAP免疫組化IHC在1941年,Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實驗。
熒光抗體技術(shù):抗原抗體反應(yīng)后,利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。免疫熒光測定:抗原抗體反應(yīng)后,利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法。免疫熒光實驗步驟:直接法測抗原:基本原理:將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低;而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢?步驟:1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上(較好可以放入24孔板),為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中,大約60-75%滿片即可,否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,現(xiàn)用現(xiàn)配。(以下各步驟切毋使玻片干燥)3. PBS沖洗;4. 0.1%Triton作用20分鐘;5. PBS沖洗;6. 10%正常血清封閉10分鐘;7. 加入一抗,4度孵育過夜(找個小瓶蓋將小玻片支起來,抗體就不容易溢出),還要記住“砸片”,就是抗體從較高處落到片子上,以分布均勻??贵w稀釋度1:60,較常用!8. PBS沖洗4次,各5分鐘;9加入熒光二抗,室溫30分鐘??贵w稀釋度1:400,較常用!10. 90%甘油封片。也很關(guān)鍵阿,多封幾次才有體會。12. 避光保存,或到顯微鏡下觀察。免疫熒光技術(shù)可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治。
免疫熒光實驗步驟:1.樣本準(zhǔn)備:細(xì)胞或薄組織。對單層生長細(xì)胞,在傳代培養(yǎng)時,將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對懸浮生長細(xì)胞,取對數(shù)生長細(xì)胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定:取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖尽R话阌?%PFA固定4℃過夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。3.洗滌:PBS洗滌5min*3次。4.打孔:選擇合適的通透劑處理樣本,目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用,幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系。AKT免疫組化IHC
免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。ALBUMIN免疫熒光IF
細(xì)胞免疫熒光簡單實驗步驟如下:1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈:3min×3。4. 1%Triton:25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈:2×5 min。6. 羊血清封閉:37度,20分鐘。7. 一抗,4度過夜,一般要大于18小時或者37度,1-2小時。8. 4度PBS洗凈,3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈,3×5 min。11. 涼干封片(封閉液PH8.5);不管采用何種方法,在使用PBS緩沖液漂洗時,都要漂洗干凈并且要測下pH值,可以使用PBS多清洗幾次,也可以延長PBS清洗時間,如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。ALBUMIN免疫熒光IF
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