CD45免疫組化IHC

來源: 發(fā)布時間:2023-10-09

免疫熒光間接法:如檢查未知抗原,先用已知未標記的特異抗體(一抗體)與抗原標本進行反應,用水洗去未反應的抗體,再用標記的抗抗體(第二抗體)與抗原標本反應,使之形成抗體—抗原—抗體復合物,再用水洗去未反應的標記抗體,干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體,則表明抗原標本是已知的,待檢血清為一抗體,其它步驟的抗原檢查相同。標記的抗抗體是抗球蛋白抗體,同于血清球蛋白有種的特異性,如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應,因此,制備標記抗體適用于任何抗原的診斷。免疫熒光技術在免疫學研究中發(fā)揮重要作用,幫助揭示細胞和分子的功能和相互關系。CD45免疫組化IHC

CD45免疫組化IHC,免疫

免疫熒光實驗的注意事項:為了保證熒光染色的正確性,初次試驗時需設置下述對照,以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標本自發(fā)熒光對照:標本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。②特異性對照(抑制試驗):標本加未標記的特異性抗體,再加熒光標記的特異性抗體。③陽性對照:已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,陽性對照和待檢標本呈強熒光,則為特異性陽性染色。一般標本在高壓汞燈下照射超過3min,就有熒光減弱現(xiàn)象,經熒光染色的標本較好在當天觀察,隨著時間的延長,熒光強度會逐漸下降。insulin免疫熒光分析免疫熒光技術可以用于研究細胞凋亡和細胞存活。

CD45免疫組化IHC,免疫

免疫熒光實驗的注意事項:對熒光標記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋度不應超過1:20,抗體濃度過低,會導致產生的熒光過弱,影響結果的觀察。染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化,染色時間可以從10min到數(shù)小時,一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于37℃可加強染色效果,但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2℃的低溫,延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。

熒光色素:四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)結構式如下:較大吸引光波長為550nm,較大發(fā)射光波長為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明,可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合,但熒光效率較低。免疫熒光技術又稱熒光抗體技術,是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合,利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。免疫熒光技術可以用于研究藥物的靶點和作用機制。

CD45免疫組化IHC,免疫

通過不同顏色熒光標記不同的靶標,可以直觀的觀察同一樣品細胞內不同結構和蛋白。熒光標記靶標的方法主要包括熒光染料、免疫標記、熒光融合蛋白等——這幾種方法均可選擇性標記細胞內的結構和蛋白,讓您在成像時更輕松地進行觀察。細胞生物學采用的很多熒光工具基本上都是熒光基團。這些熒光基團經過不同的方法修飾或結合到不同的分子上,從而具備了某些的功能與特定的細胞器或蛋白結合。通過化學修飾,單個熒光基團可以產生許多變體形式,且每種變體都有不同的特異性。熒光抗體技術可以用于檢測和定位細胞或組織中的特定抗原物質。公司免疫熒光檢查

免疫熒光技術可以用于研究細胞內分子的相互作用。CD45免疫組化IHC

免疫熒光實驗步驟:1.樣本準備:細胞或薄組織。對單層生長細胞,在傳代培養(yǎng)時,將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對懸浮生長細胞,取對數(shù)生長細胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。2.固定:取適當?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。3.洗滌:PBS洗滌5min*3次。4.打孔:選擇合適的通透劑處理樣本,目的是使抗體更容易進入細胞與抗原結合。CD45免疫組化IHC