cytokeratin18(CK18)免疫熒光分析

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細(xì)胞爬片時，動作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實驗進程。（2）種細(xì)胞過程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細(xì)胞局部生長過密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細(xì)胞爬片進行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達(dá)調(diào)控。cytokeratin18(CK18)免疫熒光分析

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍，可以測定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、藥物檢測、免疫學(xué)、血型鑒定等。許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490495nm，較大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。C-Caspas3免疫熒光抗體標(biāo)記使得抗原定位變得可視化，有助于觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。

熒光的產(chǎn)生：一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學(xué)能等）而進入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進行標(biāo)記。

細(xì)胞免疫熒光實驗常見問題:1、信號弱或者無信號：細(xì)胞或組織樣本保存時間過長；2）抗體濃度不合適，參照抗體說明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達(dá)量進行摸索；3）一抗孵育時間不合適，建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景：封閉不充分；抗體濃度過高；抗體孵育時間過長或溫度過高；清洗不充分；樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù)。

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計、流式細(xì)胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。MYeloperoxidase免疫熒光試驗

免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點和作用機制。cytokeratin18(CK18)免疫熒光分析

細(xì)胞免疫熒光實驗注意事項：1、建議細(xì)胞直接種孔板，采用倒置熒光顯微鏡拍照，這樣可以避免然后挑片時造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果；2、若實驗室只有正置熒光顯微鏡，則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片。建議直接購買處理過的細(xì)胞爬片；若只有普通細(xì)胞爬片，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜，若用酸浸泡過夜，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟。然后，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干，再將爬片置于超凈臺造紫外消毒后備用。cytokeratin18(CK18)免疫熒光分析