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免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是:特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是:非特異性染色問題尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性不足,技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同,還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比,熒光免疫法無放射性污染,并且大多操作簡(jiǎn)便,便于推廣。國(guó)外生產(chǎn)的TDM用試劑盒,有相當(dāng)一部分即屬于此類,并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問題,熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定,與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣,在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用,可以用于檢測(cè)病原體、肉瘤標(biāo)志物等。IL-6免疫熒光染色
免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng):為了保證熒光染色的正確性,初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照,以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照:標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。②特異性對(duì)照(抑制試驗(yàn)):標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽性對(duì)照:已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無熒光或弱熒光,陽性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,則為特異性陽性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min,就有熒光減弱現(xiàn)象,經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。collagen3免疫組化IHC免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用。
免疫熒光注意事項(xiàng):對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置:1、內(nèi)源性組織背景對(duì)照:某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),會(huì)產(chǎn)生背景熒光,對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響,例如色素脂褐質(zhì)。因此在孵育一抗前,應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行觀察,確保抗原本身沒有信號(hào)。2、陽性對(duì)照:用確認(rèn)含有待測(cè)抗原的組織或細(xì)胞,與待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理,結(jié)果應(yīng)為陽性,可證明待測(cè)抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對(duì)照:與陽性對(duì)照相反,用明確不含有待測(cè)抗原的細(xì)胞或組織切片染色,結(jié)果若為陰性,可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果。
熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍;與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比,成本較低。間接免疫熒光的缺點(diǎn):由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,因此物種交叉反應(yīng)性問題增加;與直接免疫熒光相比,時(shí)間更長(zhǎng)(操作步驟更多)。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn):通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大;與直接免疫熒光相比,通過信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度;熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍;與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比,成本較低。間接免疫熒光的缺點(diǎn):由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,因此物種交叉反應(yīng)性問題增加;與直接免疫熒光相比,時(shí)間更長(zhǎng)(操作步驟更多)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。
免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),因?yàn)闊晒馍夭坏芘c抗體球蛋白結(jié)合,用于檢測(cè)或定位各種抗原,也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合,用于檢測(cè)或定位抗體,但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù),或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制和醫(yī)治效果評(píng)估。IL-6免疫熒光染色
免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活。IL-6免疫熒光染色
檢測(cè)復(fù)雜的生物學(xué)結(jié)構(gòu)需要較高清晰度的熒光信號(hào),并將熒光信號(hào)從背景噪聲中分離開來。標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光標(biāo)記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于:需要精細(xì)調(diào)整樣品信號(hào)達(dá)到峰值特異性、高清晰度和較佳放大倍數(shù)。雖然熒光基團(tuán)是進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞成像的較佳選擇,但不可避免地也極易發(fā)生光漂白,即熒光信號(hào)的光化學(xué)降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差,產(chǎn)生假性結(jié)果。抗淬滅封片劑可以保護(hù)熒光標(biāo)記蛋白的穩(wěn)定性,維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的圖像信號(hào)完整度。IL-6免疫熒光染色