VEGFA免疫熒光

免疫熒光的原理和類(lèi)型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長(zhǎng)（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性，經(jīng)過(guò)短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長(zhǎng)發(fā)射光子，并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過(guò)顯微鏡觀察到。熒光團(tuán)可以通過(guò)可見(jiàn)光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長(zhǎng)范圍。它們不會(huì)損傷活細(xì)胞，可安全用于生物制劑。在進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)時(shí)，首先對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理。進(jìn)行免疫染色時(shí)，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號(hào)。根據(jù)使用的抗體和所需的信號(hào)擴(kuò)增，免疫熒光可分為直接和間接兩種類(lèi)型。免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用。VEGFA免疫熒光

熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長(zhǎng)為570nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm，呈橘紅色熒光。VEGFA免疫熒光免疫熒光技術(shù)可以用于研究?jī)?nèi)臟移植和免疫抑制。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗，37℃，室溫避光孵育1小時(shí)。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記，因此操作過(guò)程盡量在暗處進(jìn)行。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核，一般為藍(lán)色熒光；避光孵育5-10min。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，可將注射器針頭針尖向背面做個(gè)小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，注意將爬片反過(guò)來(lái)貼于多聚賴氨酸載玻片上，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，注意選擇抗體對(duì)應(yīng)的激發(fā)光源。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml，進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min，目的是使細(xì)胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(shí)（選擇的封閉液與后面操作過(guò)程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)推薦濃度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以摸索抗體的適宜濃度），4℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原的技術(shù)。

細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備：1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右，用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板，在每個(gè)孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基，然后將爬片置于液滴上，壓緊，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi)。3)24h或者48h后，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度快慢，觀察判斷細(xì)胞密度，約90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光。熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來(lái)追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。BAX免疫熒光

熒光抗原法是利用已知的熒光標(biāo)記物來(lái)追蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法。VEGFA免疫熒光

免疫熒光的制作：樣品準(zhǔn)備（貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞以及組織等）：對(duì)于貼壁細(xì)胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進(jìn)行浸泡處理，然后用干凈無(wú)菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌PBS洗去殘留的乙醇。待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，操作小心，防止細(xì)胞脫片。對(duì)于懸浮細(xì)胞：有2種方法，①先在懸浮液中進(jìn)行固定步驟，然后把細(xì)胞滴加在載玻片上，干燥后細(xì)胞會(huì)緊貼在載玻片上。②先在懸浮液中進(jìn)行固定和染色步驟，離心洗脫，然后用移液管移至盒式玻片進(jìn)行后續(xù)染色步驟。對(duì)于冷凍切片：切片放置在載玻片上后，可以直接進(jìn)行固定等后續(xù)操作。對(duì)于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少，要先進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)處理。VEGFA免疫熒光