Glucagon免疫組化IHC

細胞免疫熒光實驗常見問題:1、信號弱或者無信號：細胞或組織樣本保存時間過長；2）抗體濃度不合適，參照抗體說明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達量進行摸索；3）一抗孵育時間不合適，建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景：封閉不充分；抗體濃度過高；抗體孵育時間過長或溫度過高；清洗不充分；樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復也可以幫助解決非特異性染色；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。免疫熒光技術可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。Glucagon免疫組化IHC

細胞免疫熒光實驗注意事項：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶；孵育過程中干片；抗原熱修復過度。染色過深：一抗?jié)舛冗^高；染色試濃度過高或孵育時間過長；染色劑濃度過高或孵育時間過長。通常實驗室先固定細胞再進行通透，但若檢測抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白，進而可降低免疫熒光背景和非特異性信號；建議設陰性對照組，消除由于抗體非特異性結合而產(chǎn)生的背景染色；選擇醛類固定液時，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高。Glucagon免疫組化IHC免疫熒光技術是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質的高度發(fā)達的標記免疫技術。

熒光的產(chǎn)生：一此化學物質能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學應所引起的稱為化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術一般應用致熒光物質進行標記。

免疫熒光應用范圍：其應用范圍極其普遍，可以測定內(nèi)分泌、蛋白質、細胞因子、細胞表面抗原、多肽、核酸、受體、神經(jīng)遞質、肉瘤標志物、血藥濃度等各種生物活性物質。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、藥物檢測、免疫學、血型鑒定等。免疫熒光實驗步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次。封閉：使用封閉液對樣本進行封閉，一般1h。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。加二抗：使用間接法時需要加二抗處理，根據(jù)說明書使用合適的濃度，避光處理1h（后面步驟均需避光）。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。封片：滴一滴防淬滅劑，封片。可立即觀察后暫存4℃盡快觀察。熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術的范疇。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子，并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到。熒光團可以通過可見光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍。它們不會損傷活細胞，可安全用于生物制劑。在進行免疫熒光檢測時，首先對細胞或組織進行固定和透化處理。進行免疫染色時，熒光團與目標抗原的抗體結合，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴增，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。免疫熒光技術可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。GFP免疫組化

免疫熒光技術在生物學研究、醫(yī)學診斷和藥物開發(fā)等領域具有普遍應用。Glucagon免疫組化IHC

細胞免疫熒光實驗注意事項：根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認是否需要加入 Triton 進行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達到效果；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光。縮短在熒光顯微鏡下的觀察時間，1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色：烤片溫度過高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過低，孵育是否時間過短等。Glucagon免疫組化IHC