湖北蛋白蛋白互作檢測CoIP-Mass

來源: 發(fā)布時間:2024-10-17

Co-IP技術(shù)作為研究蛋白質(zhì)相互作用的重要手段,其結(jié)果在多數(shù)情況下是可靠的。然而,該技術(shù)也存在一些潛在的限制和影響因素,需要研究人員予以注意。在實際應(yīng)用中,由于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)種類繁多且相互作用復(fù)雜,可能會出現(xiàn)非特異性結(jié)合或背景噪聲,這要求研究者選擇特異性強(qiáng)的抗體,并通過洗滌步驟去除雜質(zhì)。此外,樣品的純度、抗體的質(zhì)量和實驗條件等也會對結(jié)果產(chǎn)生影響,因此,對抗體的選擇和驗證、樣品的準(zhǔn)備以及實驗條件的控制都至關(guān)重要。為了進(jìn)一步提高結(jié)果的準(zhǔn)確性,研究人員通常會結(jié)合多種方法進(jìn)行相互驗證,如使用不同抗體或?qū)嶒灄l件重復(fù)實驗,或結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)來驗證Co-IP的結(jié)果。這些措施共同增強(qiáng)了Co-IP技術(shù)結(jié)果的可靠性。免疫共沉淀法證實蛋白互作,基于抗體專一性,揭示生理性相互作用。湖北蛋白蛋白互作檢測CoIP-Mass

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Co-IP實驗原理主要基于抗原-抗體特異性結(jié)合以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。具體來說,當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時,細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用會被保留下來。實驗中,利用靶蛋白的特異性抗體與靶蛋白結(jié)合形成復(fù)合物,然后通過免疫反應(yīng)將復(fù)合物與固定在固相支持物(如瓊脂糖珠或磁珠)上的親和劑(如Protein A/G)結(jié)合。經(jīng)過一系列的洗滌步驟后,可以去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì),將目標(biāo)蛋白質(zhì)及其相互作用的蛋白質(zhì)富集在固相支持物上。通過電泳、質(zhì)譜分析等技術(shù)對富集的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,從而鑒定和定量相互作用的蛋白質(zhì)。陜西免疫共沉淀檢測CoIP-MSCo-IP外源檢測引入外源蛋白驗證互作,敏感度高但需嚴(yán)控條件,結(jié)合內(nèi)源檢測更準(zhǔn)確!

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免疫共沉淀又叫Co-IP,是利用抗原A與蛋白B結(jié)合,通過A的抗體沉淀A,再利用精制的prorein A/G預(yù)先結(jié)合到磁珠上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后,磁珠上的prorein A/G就能吸附抗原,從而獲得抗原A與蛋白B的復(fù)合體,之后就可以對B進(jìn)行檢測,從而獲得蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的信息。

免疫共沉淀的優(yōu)點

相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的,處于天然狀態(tài);(2)蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的,可以避免人為的影響;(3)可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物;(4)能夠?qū)﹂g接相互作用的蛋白進(jìn)行捕獲,比如對蛋白復(fù)合物的多種成分進(jìn)行鑒定;(5)可以研究具有修飾的目的蛋白;(6)操作流程較為簡便,不需要事先制備大規(guī)模蛋白表達(dá)文庫。

Co-IP(免疫共沉淀)技術(shù)的基本原理是基于抗原與抗體之間的特異性結(jié)合,從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)相互作用的研究。在Co-IP實驗中,研究人員使用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合,形成抗原-抗體復(fù)合物。這個復(fù)合物隨后被吸附到固化了蛋白A或G的支持物上,由于這些蛋白具有吸附抗體的能力,因此相應(yīng)的抗原分子及其相互作用蛋白質(zhì)也被一同吸附。這個過程稱為沉淀。接下來,未被沉淀的蛋白質(zhì)通過緩沖液的流洗被去除,確保只有與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)被保留下來。這些被沉淀的蛋白質(zhì)復(fù)合物隨后被洗脫下來,并通過特定的檢測方法進(jìn)行分析,從而證實蛋白質(zhì)之間的相互作用。Co-IP技術(shù)為深入研究蛋白質(zhì)相互作用提供了有力工具,有助于揭示蛋白質(zhì)的功能和調(diào)控機(jī)制。Co-IP技術(shù)揭示蛋白互作,助力藥物研發(fā)與疾病機(jī)制探索!

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IP-WB(免疫沉淀-Western Blot)實驗流程主要包括以下步驟:樣品制備:收集細(xì)胞或組織樣品,進(jìn)行適當(dāng)?shù)牧呀馓幚?,以釋放?xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。免疫沉淀:將特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合,形成抗原-抗體復(fù)合物。隨后,將復(fù)合物與固相載體(如磁珠)結(jié)合,通過洗滌去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。電泳分離:將免疫沉淀得到的蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,根據(jù)分子量大小將蛋白質(zhì)分離成不同的條帶。轉(zhuǎn)膜:將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上,以便進(jìn)行后續(xù)的Western Blot檢測。Western Blot檢測:利用特異性抗體檢測目標(biāo)蛋白或其相互作用伙伴的存在。通過顯色反應(yīng)可視化目標(biāo)蛋白,觀察并記錄結(jié)果。以上步驟完成后,可以對Western Blot結(jié)果進(jìn)行分析,從而驗證蛋白質(zhì)之間的相互作用情況。Co-IP揭示蛋白互作,驗證復(fù)合物形成,探究信號通路,助力蛋白研究!山西免疫沉淀檢測CoIP-MS檢測

Co-IP內(nèi)源檢測需注意抗體選擇、實驗條件、樣本處理及驗證,確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠!湖北蛋白蛋白互作檢測CoIP-Mass

CoIP-Mass和CoIP-WB優(yōu)劣勢:優(yōu)勢:高通量獲得目的蛋白的專屬蛋白互作庫。劣勢:CoIP的蛋白庫魚龍混雜,包含目的蛋白的直接/間接互作蛋白,非特異結(jié)合,殘留蛋白。常規(guī)理想IP-Mass項目可鑒定到1000-2000個蛋白,其中絕大部分是非特異性結(jié)合及清洗殘留的背景蛋白,導(dǎo)致CoIP-Mass假陽性高,CoIP-WB驗證成功率低,導(dǎo)致研發(fā)進(jìn)展反復(fù)跌宕,時間和經(jīng)費成本占用較大,嚴(yán)重影響士氣。其次,項目受限于蛋白表達(dá)量和IP抗體有效性,達(dá)到理想狀態(tài)的CoIP-Mass較難,同時分析門檻較高。因此,該項目成功實施,比較依賴成熟和有分析經(jīng)驗的團(tuán)隊。建議整包交給專業(yè)的服務(wù)商開展檢測。湖北蛋白蛋白互作檢測CoIP-Mass

標(biāo)簽: 蛋白組芯片 RIP ChIP CoIP