高活性/無非特異酶活PNGaseF去糖基化酶疾病機理研究

C1抑制劑的去糖基化：在O-糖基化生物制藥的生產(chǎn)過程中，由于he心GalNAc殘基的加工不完全，可能會出現(xiàn)Tn抗原。這表現(xiàn)為具有 203 Da HexNAc 單位差異的重復(fù)質(zhì)量位移。為了確認 Tn 抗原的存在，可以應(yīng)用以下工作流程，此處在重度（26 個位點）O-糖基化 C1 抑制劑上演示。首先，使用PNGaseF修剪糖蛋白的N-糖，使用Genovis的OglyZOR和SialEXO修剪he心1 O-糖。依那西普的磷性能測試?：依那西普是另一種具有挑戰(zhàn)性的生物制藥模型分子，攜帶 13 個 O-聚糖位點，其中平均 9 至 10 個位點被占用。Genovis測試了 SialEXO 凍干和 SialEXO 固定化在人 C1 抑制劑上的性能。高活性/無非特異酶活PNGaseF去糖基化酶疾病機理研究

從依那西普水解β1-3和β1-4半乳糖：Genovis的GalactEXO Immobilized 對 β1-3 和 β1-4 連接的半乳糖均具有酶活性，這些半乳糖存在于裝飾有 N- 和 O-連接糖基化的生物制藥中，例如 Fc-融合蛋白依那西普。將依那西普與GalactEXO固定化孵育60分鐘，并在FabRICATOR消化后使用LC-MS在亞基水平上研究酶活性。TNFR和Fc/2片段分別分析。與GalactEXO Immobilized孵育導(dǎo)致N-連接和O-連接聚糖上的半乳糖殘基水解，這在半乳糖基化物種中被視為信號丟失。對游離的N-聚糖分析證實了LC-MS數(shù)據(jù)。瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶疾病機理研究FucosEXO 可在 1 至 2 小時內(nèi)水解糖蛋白上的末端 α1-2,3,4 。

OglyZOR 來源于口腔鏈球菌，在大腸桿菌中表達。該酶含有 His 標簽，分子量為 227 kDa。SialEXO來源于Akkermansia muciniphila，在大腸桿菌中表達。SialEXO酶含有His標簽，組分的分子量分別為42 kDa和66 kDa。1.高效O-糖苷酶；2. 降低樣品異質(zhì)性，揭示潛在的關(guān)鍵蛋白質(zhì)修飾；3. 完全、穩(wěn)健地去除 O-糖he心 1 二糖。Genovis的凍干酶，用于水解糖蛋白上的he心1 O-聚糖。OglyZOR 凍干劑以凍干粉的形式提供，裝在 2000 個單位的小瓶中，用于在 2 mg 糖蛋白上水解he心 1 O-聚糖。它需要去除唾液酸助劑才能發(fā)揮作用，因此與2000單位的SialEXO凍干一起提供。

為了證明Genovis的PNGase F凍干和PNGase F固定在各種底物上的去糖基化能力，用PNGase F凍干或PNGase F固定化處理了一系列糖蛋白。使用天然反應(yīng)條件在一小時內(nèi)有效去除曲妥珠單抗和依那西普上的所有N-糖，以及西妥昔單抗上的Fc-糖。當(dāng)加入RapiGest?并在變性條件下進行反應(yīng)時，西妥昔單抗的所有N-聚糖（包括Fab-聚糖）在PNGase F固定化10分鐘內(nèi)完全去除，PNGase F固定化15分鐘內(nèi)完全去除。在變性反應(yīng)條件下，PNGase F 在 30 分鐘內(nèi)成功將更復(fù)雜的 F 融合蛋白阿巴西普和阿柏西普去糖基化。使用變性和還原反應(yīng)條件，將常用的糖蛋白標準品RNase B在10或15分鐘內(nèi)完全去糖基化，分別使用PNGase F凍干或PNGase F固定化。在天然和變性條件下生成的去糖基化樣品與LC-MS分析兼容。SialEXO、FabRICATOR消化去糖基化蛋白，通過中級質(zhì)譜測定完整質(zhì)量數(shù)。

GlycOCATCH用于純化粘蛋白型O-糖基化蛋白和肽。它是基于無活性的Genovis的OpeRATOR?酶，該酶經(jīng)過工程改造，可以高親和力結(jié)合O-糖基化蛋白和肽。GlycOCATCH的應(yīng)用包括O糖蛋白和肽的特異性富集或去除、糖組學(xué)、復(fù)雜樣品的研究和生物制藥的表征。1. 粘蛋白型O-糖基化蛋白和肽的特異性富集；2. 可靠 - 高親和力結(jié)合;3. 快速且易于使用的工作流程。不需要輔助因子或特殊緩沖液。GalNAcEXO中的酶來源于Akkermansia muciniphila，在大腸桿菌中表達，帶有His標簽，分子量為52 kDa。1. 用于方法開發(fā)的靈活格式；2. 可以結(jié)合酶以提高效率；3. 適用于自動化工作流程； 4. 即用型 - 只需加水即可！用于水解糖蛋白上GalNAc殘基的凍干酶。Genovis的GalNAcEXO凍干劑以凍干粉末的形式提供，裝在2000單位的小瓶中，用于水解2mg糖蛋白上的GalNAc殘基。SialEXO酶來源于Akkermansia muciniphila，并在大腸桿菌中表達。浙江凍干粉形式PNGaseF去糖基化酶疾病機理研究

用SialEXO處理血清，上樣于GlycOCATCH，洗滌，洗脫O-糖基化蛋白。Swiss Prot 數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)列表。高活性/無非特異酶活PNGaseF去糖基化酶疾病機理研究

用于離心柱中糖蛋白去膠基化的固定化酶。Genovis的FucosEXO固定化離心柱含有與瓊脂糖珠共價偶聯(lián)的FucosEXO酶，用于糖蛋白的去氟糖基化，而不會用酶污染z終制劑。Microspin 色譜柱可用于 5 或 10 x 0.5 mg 糖蛋白的去膠基化。1. 易于使用的離心柱；2. 提高酶與底物的比例，提高消化效率；3. z終樣品中不含酶。有效去除α1-2,3,4連接巖藻糖：分析用復(fù)雜聚糖結(jié)構(gòu)修飾的糖蛋白可能具有挑戰(zhàn)性，需要高效和特異性的酶學(xué)工具。Genovis的FucosEXO 是 α-巖藻糖苷酶的混合物，用于有效水解 N-和 O-糖蛋白或寡糖上的 α1-2、α1-3 和 α1-4 連接的巖藻糖殘基，無需輔助因子或添加高活性/無非特異酶活PNGaseF去糖基化酶疾病機理研究