海南瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶蛋白質(zhì)組學(xué)研究

由于蛋白質(zhì)的O-糖模式的異質(zhì)性和O-糖結(jié)構(gòu)的OpeRATOR特異性，形成了重疊的肽，從而可以獲得O-糖位點(diǎn)的完整圖譜為了進(jìn)行比較，相同材料的標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶消化物， 顯示難以分析的少量且非常大的糖肽。使用Genovis的OpeRATOR進(jìn)行O-糖位點(diǎn)定位：OpeRATOR 是一種 O-聚糖特異性蛋白酶，可消化絲氨酸和蘇氨酸糖基化位點(diǎn)的粘蛋白型 O-糖蛋白 N 端。這會(huì)產(chǎn)生攜帶O-糖的糖肽，并能夠使用質(zhì)譜法進(jìn)行O-糖分析、O-糖肽圖譜以及中級分析。下面是OpeRATOR消解位點(diǎn)的示意圖。SialEXO是用于去除和分析唾液酸的唾液酸酶；海南瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶蛋白質(zhì)組學(xué)研究

在Genovis的PNGaseF去除N-聚糖并用SialEXO和GalactEXO截?cái)郞-聚糖后，在質(zhì)譜圖中觀察到幾個(gè)與GalNAcs相關(guān)的峰。為了去除剩余的GalNAc殘基，應(yīng)用GalNAcEXO酶。用GalNAcEXO處理后觀察到的單個(gè)蛋白峰顯示完全去除剩余的GalNAcs。?GalNAcEXO在生理緩沖液和中性pH值中具有活性，使其與大多數(shù)樣品相容。此外，GalNAcEXO的活性不依賴于任何可能影響LC-MS分析的輔因子，如BSA。根據(jù)底物的性質(zhì)，糖蛋白的GalNAcEXO反應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)完成，而更復(fù)雜的樣品可能需要孵育過夜。Genovis的GalNAcEXO也可固定在離心柱中，以便快速方便地處理樣品，在制備過程中不會(huì)殘留酶。河南凍干粉形式PNGaseF去糖基化酶瑞典GenovisSialEXO凍干由兩種唾液酸酶組成，每種唾液酸酶都具有獨(dú)特的活性，并且它們同時(shí)起作用。

FucosEXO中的酶在大腸桿菌中表達(dá)，帶有His標(biāo)簽，分子量為87 kDa和64 kDa。FucosEXO在天然條件下水解糖蛋白上的巖藻糖，在6至8的pH值范圍內(nèi)顯示出高活性，無需輔助因子或添加劑。1. 用于方法開發(fā)的靈活格式；2. 可以結(jié)合酶以提高效率；3. 適用于自動(dòng)化工作流程；4.即用型 - 只需加水即可。Genovis的FucosEXO 是 α-巖藻糖苷酶的混合物，用于在 N-和 O-糖基化蛋白或游離寡糖上有效水解 α1-2、α1-3 和 α1-4-連接的巖藻糖。人血清中 O-糖蛋白的富集：GlycOCATCH還可用于從復(fù)雜的樣品混合物（如人血清）中選擇性富集O-糖基化蛋白。簡而言之，用Genovis的SialEXO處理血清并應(yīng)用于GlycOCATCH樹脂。洗滌樹脂，用8M尿素洗脫O-糖基化蛋白。用胰蛋白酶消化樣品并使用 RP-LC-MS/MS 進(jìn)行分析，并使用 Swiss Prot 數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)列表。O-糖基化蛋白以黃色表示。

genvois的OpeRATOR 是一種內(nèi)切蛋白酶，可催化直接靠近 O-聚糖的天然粘蛋白型 O-糖基化蛋白的肽鍵的水解。內(nèi)切蛋白酶具有高特異性，可消化絲氨酸或蘇氨酸殘基的O-聚糖N端的蛋白質(zhì)。 OpeRATOR 活性需要粘蛋白型的 O-聚糖，并且該酶不會(huì)用 N-連接聚糖消化糖蛋白。該酶對具有亞洲化he心1 O-聚糖的位點(diǎn)z活躍。它還消化唾液酸化的he心 1 和he心 3，但程度要低得多。為了獲得z佳性能，需要去除唾液酸，因此，SialEXO凍干（唾液酸酶混合物）包含在購買中。 SialEXO和GalactEXO截?cái)郞-聚糖后，應(yīng)用GalNAcEXO酶去除剩余的GalNAc殘基。

Genovis的ImpaRATOR? 可用于多種 O-聚糖：依那西普是一種融合蛋白，由TNF受體的胞外結(jié)構(gòu)域與人IgG1的Fc部分相連。該蛋白質(zhì)在Fc區(qū)域上方含有多達(dá)13個(gè)O-糖基化的Ser/Thr殘基簇，使其成為一種非常難以在結(jié)構(gòu)上表征的生物制藥。為了證明ImpaRATOR的聚糖特異性，制備了三種具有不同聚糖組成的依那西普樣品：（i）攜帶單唾液酸和二唾液酸化he心1結(jié)構(gòu)混合物的未經(jīng)處理的糖蛋白，（ii）用SialEXO處理的糖蛋白去除唾液酸并產(chǎn)生裸核1結(jié)構(gòu)，以及（iii）用SialEXO和GalactEXO處理的糖蛋白產(chǎn)生單個(gè)GalNAc殘基， 也稱為Tn抗原。用ImpaRATOR和FabRICATOR在一鍋反應(yīng)中處理三個(gè)樣品（圖1）。作為比較，SialEXO處理的依那西普用OpeRATOR和FabRICATOR處理。將所得肽還原、烷基化并用HILIC-MS進(jìn)行分析。FabRICATOR被包括在反應(yīng)中，以將Fc區(qū)與大多數(shù)C端糖肽分離，以促進(jìn)其表征。OglyZOR 來源于口腔鏈球菌，在大腸桿菌中表達(dá)。該酶含有 His 標(biāo)簽，分子量為 227 kDa。陜西凍干粉形式PNGaseF去糖基化酶

上海倍篤生物涵蓋藥物研發(fā)的全流程，抗體結(jié)構(gòu)域分析蛋白酶、蛋白聚糖分析水解酶等。海南瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶蛋白質(zhì)組學(xué)研究

水解O-聚糖的酶不會(huì)從變性中獲益，這就是為什么OmniGLYZOR色譜柱只能在天然條件下使用的原因。 OmniGLYZOR 試劑盒 Microspin 以含有足夠材料的試劑盒形式提供，可使5 × 50-100 μg 或 10 × 50-100 μg 糖蛋白去糖酸化。N-和O-連接聚糖的快速高效；與LC-MS兼容；完全去除聚糖，改進(jìn)基礎(chǔ)蛋白的分析；固定形式可提高酶與底物的比率，從而實(shí)現(xiàn)快速去糖基化。 IgdE酶(FabALACTICA?)和PNGaseF酶分別購自Genovis(馬薩諸塞州，美國)。用于水解糖蛋白上N-聚糖的凍干酶。Genovis的PNGase F 凍干劑以凍干粉的形式提供，裝在 1000 或 5 x 1000 單位小瓶中，分別用于消化 1 mg 或 5 x 1 mg 糖蛋白。海南瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶蛋白質(zhì)組學(xué)研究