AKT如何調(diào)控其蛋白穩(wěn)定性？

來源：發(fā)布時間：2024-10-24

第一步，TRPML1是通過泛素蛋白酶體途徑降解的

蛋白酶體抑制劑MG132以濃度依賴的方式增強TRPML1的蛋白豐度，而BafaA1對TRPML1沒有影響，表明TRPML1是通過泛素蛋白酶體途徑降解的（圖1a）。

第二步，β-TrCP可能是TRPML1泛素化的主要E3連接酶

Co-IP實驗顯示，β-TrCP過表達上調(diào)TRPML1泛素化水平，β-TrCP ΔF的失HUO體則不能（圖1c）；此外，下調(diào)β-TrCP可降低TRPML1泛素化水平（圖1d）。另外，Co-IP分析發(fā)現(xiàn)，K48R泛素突變體破壞了TRPML1的多泛素化，而K63R突變體則沒有。此外，β-TrCP過表達后，K48相關(guān)的TRPML1泛素化增加（圖1e-f）。表明TRPML1主要通過K48連接泛素化。

綜上，β-TrCP可能是TRPML1泛素化的主要E3連接酶，通過lys48連接的多泛素鏈對TRPML1進行蛋白酶體降解。

第三步，探索S343磷酸化對K48連接的泛素化和TRPML1蛋白酶體降解的影響

Co-IP實驗發(fā)現(xiàn)，TRPML1-S343D激HUO突變體抑制了TRPML1與β-TrCP的互作，而S343A失活突變體促進了這種互作（圖1g）。Co-IP還發(fā)現(xiàn)，S343D突變體抑制TRPML1的泛素化，而S343A失活突變體增強泛素化（圖1h）。另外，β-TrCP敲除延長了TRPML1-S343A的半衰期（圖1i），表明S343磷酸化抑制了β-TrCP介導(dǎo)的K48泛素化和TRPML1的蛋白酶體降解。

第四步，確定TRPML1中哪些賴氨酸殘基可能被泛素化

采用預(yù)測系統(tǒng)軟件預(yù)測TRPML1的潛在泛素化位點，包括K55、K59、K62、K65、K219、K224、K227、K378和K552。構(gòu)建野生型和潛在泛素化位點失活突變體【備注：泛素化失活突變體，賴氨酸(K)轉(zhuǎn)精氨酸(R)】，進行Co-IP分析。發(fā)現(xiàn)K552R突變抑制了TRPML1的K48連鎖泛素化（圖1j），表明TRPML1K552位點泛素化；另外，β-TrCP無法促進TRPML1-K552R泛素化（圖1k）。CHX脈沖追蹤實驗發(fā)現(xiàn)外源表達的TRPML1-K552R在CHX處理后比野生型TRPML1更穩(wěn)定（圖1l）。

表明AKT通過直接磷酸化TRPML1的Ser343位點，抑制K552泛素化和TRPML1的蛋白酶體降解，從而增強溶酶體胞吐作用。

圖1 AKT 穩(wěn)定TRPML1 促進鐵死亡抵抗（Ref. Fig 3/S9）

后續(xù)實驗證實，敲除內(nèi)源性TRPML1，外源表達TRPML1-WT、TRPML1-S343A、TRPML1-S343D或突變的TRPML1-K552R，發(fā)現(xiàn)活化的AKT增強231-TRPML1-WT細胞的溶酶體胞吐和降低鐵死亡敏感性，而在TRPML1-S343A細胞中則沒有（圖2a）。此外，TRPML1-S343D細胞顯示溶酶體胞吐增強和鐵死亡敏感性降低，而溶酶體胞吐抑制劑TA可以逆轉(zhuǎn)增強的溶酶體胞吐和降低的鐵死亡敏感性（圖2b-c）。表明AKT穩(wěn)定TRPML1可促進溶酶體胞吐，進而誘導(dǎo)AI細胞對鐵死亡的抵抗。