T5核酸外切酶(T5Exonuclease)具有以下特點(diǎn)和技術(shù)應(yīng)用:1.**降解方向**:T5核酸外切酶按照5'→3'方向降解雙鏈或單鏈DNA。2.**起始消化位置**:T5核酸外切酶既能從單鏈或雙鏈DNA的5'末端起始消化,也可以從線性或環(huán)狀雙鏈DNA的缺口(gap)或缺刻(nick)處起始消化。3.**對(duì)超螺旋雙鏈DNA的作用**:T5核酸外切酶無(wú)法降解超螺旋雙鏈DNA。4.**單鏈DNA核酸內(nèi)切酶活性**:T5核酸外切酶還具有單鏈DNA核酸內(nèi)切酶活性。5.**應(yīng)用領(lǐng)域**:-用于Gibson組裝,這是一種在恒溫條件下有效連接帶有多個(gè)重疊序列片段的技術(shù)。-從完全連接的環(huán)狀雙鏈DNA中去除不完全連接產(chǎn)物。-降解堿裂解質(zhì)粒提取方法中產(chǎn)生的變性DNA,增加超螺旋DNA比例,提高DNA克隆和轉(zhuǎn)染效率。-降解質(zhì)粒樣品中污染的線性化和切刻DNA。6.**操作條件**:推薦在37℃溫育30分鐘,之后加入EDTA至終濃度為20mM終止反應(yīng)。7.**儲(chǔ)存條件**:-25~-15℃保存,有效期3年。8.**注意事項(xiàng)**:避免起泡或劇烈攪拌、渦旋等操作,以防止本品失活。這些特點(diǎn)和技術(shù)應(yīng)用使得T5核酸外切酶在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中,尤其是在DNA克隆和基因片段組裝中,具有重要的應(yīng)用價(jià)值。多泛素化的靶蛋白被26S蛋白酶體識(shí)別。26S蛋白酶體由一個(gè)20S顆粒和兩個(gè)19S調(diào)節(jié)顆粒組成。Recombinant Human MCP-4/CCL13
在PCR實(shí)驗(yàn)中,防止非特異性擴(kuò)增的關(guān)鍵在于優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和采取一些特定的策略。以下是一些有效的方法:1.**優(yōu)化引物設(shè)計(jì)**:引物設(shè)計(jì)是PCR成功的關(guān)鍵。應(yīng)確保引物序列具有高度特異性,避免與非目標(biāo)序列互補(bǔ)。使用在線工具進(jìn)行引物設(shè)計(jì),并進(jìn)行BLAST搜索以確認(rèn)特異性。2.**使用熱啟動(dòng)PCR**:熱啟動(dòng)PCR技術(shù)可以抑制室溫下的DNA聚合酶活性,減少非特異性擴(kuò)增。這種方法通過(guò)在高溫下激起酶的活性,從而在PCR體系配制階段降低引物與模板或引物與引物之間的非特異性結(jié)合。3.**調(diào)整Mg2+濃度**:Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有重要影響。過(guò)高的Mg2+濃度可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增,因此需要優(yōu)化Mg2+濃度以獲得比較好的結(jié)果。4.**退火溫度優(yōu)化**:退火溫度對(duì)PCR特異性至關(guān)重要。較高的退火溫度有助于減少非特異性結(jié)合,但過(guò)高的退火溫度可能會(huì)降低引物與模板的結(jié)合效率。通常,退火溫度設(shè)置比引物的Tm值低5°C左右。5.**使用降落PCR**:降落PCR(TouchdownPCR)通過(guò)在初始循環(huán)中使用較高的退火溫度,然后逐漸降低退火溫度,從而在PCR開(kāi)始時(shí)減少非特異性擴(kuò)增,同時(shí)在后續(xù)循環(huán)中保持特異性擴(kuò)增。EGFRvIII peptide (PEPvIII)Multiplex Probe qPCR Mix 是一種濃縮預(yù)混液,含有抗體技術(shù)修飾的熱啟動(dòng)酶Hotstart Taq DNA聚合酶。
核酸內(nèi)切酶VIII(EndonucleaseVIII)和核酸內(nèi)切酶III(EndonucleaseIII)都是DNA修復(fù)酶,但它們之間存在一些關(guān)鍵的區(qū)別:1.**活性類型**:-**核酸內(nèi)切酶VIII**:具有N-糖基化酶(N-glycosylase)活性和AP裂解酶(AP-lyase)活性。N-糖基化酶活性可以釋放受損的嘧啶堿基,如胸腺嘧啶乙二醇和尿嘧啶乙二醇,產(chǎn)生一個(gè)脫嘌呤(Apurinic,AP)位點(diǎn);AP裂解酶活性可以切割A(yù)P位點(diǎn)的3'和5'端,產(chǎn)生一個(gè)具有3'和5'磷酸的堿基缺口(Gap)。-**核酸內(nèi)切酶III**:主要具有β裂解酶(β-lyase)活性,能夠切割DNA磷二酯骨架在AP位點(diǎn)處,但不具備δ裂解酶(δ-lyase)活性。2.**識(shí)別和切除的受損堿基**:-**核酸內(nèi)切酶VIII**:可以識(shí)別并切除包括尿素、5,6-二羥基胸腺嘧啶、胸腺嘧啶乙二醇、5-羥基-5-甲內(nèi)酰脲、尿嘧啶乙二醇、6-羥基-5,6-二氫胸腺嘧啶和甲基羥丙二酰脲在內(nèi)的多種受損堿基。-**核酸內(nèi)切酶III**:主要識(shí)別和切除氧化性損傷的嘌呤堿基,如8-氧鳥(niǎo)嘌呤。3.**裂解酶活性**:-**核酸內(nèi)切酶VIII**:具有β和δ裂解酶活性,而**核酸內(nèi)切酶III**具有β裂解酶活性。這些區(qū)別決定了它們?cè)贒NA損傷修復(fù)中的作用和應(yīng)用范圍。
Lambda核酸外切酶(LambdaExonuclease,簡(jiǎn)稱λExonuclease)是一種具有特定特性和應(yīng)用的酶,以下是其主要特點(diǎn)和應(yīng)用:1.**特異性作用**:λExonuclease是一種5'→3'核酸外切酶,能選擇性地沿5'→3'方向消化5'端磷酸化的雙鏈DNA。2.**酶切活性**:對(duì)單鏈DNA和5'端未磷酸化修飾的DNA的酶切活性較低,不能從DNA的切刻或缺口處起始消化。3.**嗜磷酸性**:該酶具有非常強(qiáng)的嗜磷酸性,磷酸化的核酸鏈與非磷酸化的核酸鏈的切割效率相差達(dá)200倍以上。4.**切割效率**:Lambda核酸外切酶是一種具有高度持續(xù)性的堿性核酸外切酶,可以連續(xù)地將核酸切割成為單個(gè)堿基,切割比較高速率可以達(dá)到1000nt/S。5.**應(yīng)用領(lǐng)域**:-生成單鏈PCR產(chǎn)物用于DNA測(cè)序。-DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析。-滾環(huán)擴(kuò)增。-從雙鏈DNA片段生成單鏈DNA。-PCR產(chǎn)物的克隆。-質(zhì)粒制備凈化。6.**酶活性定義**:Oneunitisdefinedastheamountofenzymerequiredtoproduce10nmolofacid-solubledeoxyribonucleotidefromdouble-strandedsubstrateinatotalreactionvolumeof50μlin30minutesat37oCin1XLambdaExonucleaseReactionBufferwith1μgsonicatedduplex[3H]-DNA。CRISPR-Cas12a(以前稱為Cpf1)是一種類II型V型內(nèi)切酶,偏好富含胸腺嘧啶的原間隔短回文重復(fù)序列鄰近基序。
在PCR實(shí)驗(yàn)中,除了BsuDNAPolymerase,還有幾種聚合酶適合高溫?cái)U(kuò)增,包括:1.**TaqDNAPolymerase**:這是常用的PCR聚合酶,來(lái)源于Thermusaquaticus,能夠在72°C的比較好活性溫度下工作。它具有良好的熱穩(wěn)定性,可以承受PCR的熱變性步驟,且中途不需要再添加酶。2.**PfuDNAPolymerase**:來(lái)源于Pyrococcusfuriosus,具有出色的熱穩(wěn)定性和3'→5'外切酶活性,提供校正功能,適用于對(duì)PCR保真性要求較高的實(shí)驗(yàn),如基因篩選、克隆表達(dá)、突變檢測(cè)、定點(diǎn)突變等。3.**VentDNAPolymerase**:來(lái)源于Litoralis棲熱球菌,具有3'→5'外切酶活性,可以去除錯(cuò)配的堿基,具有校對(duì)功能,保真度比TaqDNAPolymerase高5~15倍。4.**KODDNAPolymerase**:來(lái)自Thermococcuskodakaraensis,具有高保真性和高熱穩(wěn)定性,保真性比PfuDNAPolymerase更高,優(yōu)化后的PCR反應(yīng)緩沖液能使得其擴(kuò)增速度達(dá)到Taq酶的2倍、Pfu酶的5-6倍。5.**BstDNAPolymerase**:來(lái)源于Bacillusstearothermophilus,具有3'到5'外切割活性,適用于等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng),如LAMP技術(shù),可在恒溫下進(jìn)行DNA擴(kuò)增,無(wú)需繁瑣的溫度循環(huán)。泛素從E1轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶E2的活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基上,形成E2-泛素硫酯中間體。Recombinant Human Neurturin
許多Probe qPCR Mix (2×)產(chǎn)品采用熱啟動(dòng)DNA聚合酶,能減少非特異性擴(kuò)增,提高反應(yīng)的靈敏度和特異性 。Recombinant Human MCP-4/CCL13
在PCR實(shí)驗(yàn)中,為了避免引物與已知序列的交叉反應(yīng),從而確保實(shí)驗(yàn)的特異性,以下是一些關(guān)鍵的引物設(shè)計(jì)原則和策略:1.**選擇高保守性區(qū)域**:引物比較好設(shè)計(jì)在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi),這樣可以確保引物與目標(biāo)序列的特異性結(jié)合。通過(guò)比較不同物種的同一基因序列,可以確定基因的保守區(qū)。2.**避免引物與非目標(biāo)序列的同源性**:設(shè)計(jì)引物時(shí),應(yīng)避免與基因組中的重復(fù)序列、假基因或高同源性區(qū)域設(shè)計(jì)引物??梢酝ㄟ^(guò)BLAST等工具對(duì)引物進(jìn)行同源性分析,確保引物只與目標(biāo)序列結(jié)合。3.**引物長(zhǎng)度和GC含量**:引物長(zhǎng)度一般在15-30堿基之間,常用的是18-27bp。GC含量一般為40%-60%,以45-55%為宜。過(guò)高或過(guò)低的GC含量都不利于引發(fā)反應(yīng),上下游引物的GC含量和Tm值應(yīng)保持接近。4.**避免引物的3'端錯(cuò)配**:引物3'端的堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),特別是倒數(shù)第二個(gè)堿基,以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。引物3'端比較好不要選擇A,比較好選擇T,因?yàn)楫?dāng)末位鏈為T(mén)時(shí),錯(cuò)配的引發(fā)效率降低。5.**避免引物自身及引物之間的互補(bǔ)序列**:引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu),影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。前后引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性,尤其應(yīng)避免3'端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體的形成。Recombinant Human MCP-4/CCL13