浙江EDTA胰酶常見問題

胰酶細(xì)胞消化液(Trypsin-EDTASolution)含0.25%胰酶（Trypsin）、0.02%EDTA和酚紅,不含Ca2＋和Mg2＋。該消化液已用0.22μm濾膜過濾除菌,可以直接用于培養(yǎng)細(xì)胞的消化,或者一些組織的消化。本胰酶細(xì)胞消化液具有方便快速的特點(diǎn),通常室溫消化1分鐘左右就可以消化下大多數(shù)貼壁細(xì)胞。使用說明：貼壁細(xì)胞的消化：1、吸去培養(yǎng)液,用無(wú)菌的PBS、Hanks液或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次,以去除殘余的血清。2、加入少量胰酶細(xì)胞消化液（含酚紅）,略蓋過細(xì)胞即可,室溫放置30秒至2分鐘。不同的細(xì)胞消化時(shí)間有所不同。3、顯微鏡下觀察,細(xì)胞明顯收縮,并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化,或者用***吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來；此時(shí)吸除胰酶細(xì)胞消化液；加入含血清的完全細(xì)胞培養(yǎng)液,吹打下細(xì)胞,即可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4、如果發(fā)現(xiàn)消化不足,則加入胰酶細(xì)胞消化液重新消化。5、如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時(shí)間過長(zhǎng),未及吹打細(xì)胞,細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落,直接用胰酶細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鐘,沉淀細(xì)胞,盡量去除胰酶細(xì)胞消化液后,加入含血清的完全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞,即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)中胰酶的作用一般是分解脂肪等。浙江EDTA胰酶常見問題

對(duì)一般細(xì)胞0.25%胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)配方：100mlPBS,0.25g胰酶步驟：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O/2.9gPO4HNa2,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸餾水)2稱胰酶0.25g3加入PBS中，低速攪拌〈4h冰浴中,或者4℃過夜低速攪拌0.5h冰浴中4調(diào)PH7.45仍在冰浴中6過濾，分裝，-20℃保存，4℃短期內(nèi)用完tip:低速很重要，機(jī)械攪拌對(duì)酶是一種沖擊，如果起沫，酶就變性了。低溫，防止酶失活對(duì)難消化的細(xì)胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)tip:因?yàn)镋DTA可以絡(luò)合Ca2，增加消化效力山東國(guó)產(chǎn)胰酶供應(yīng)商胰蛋白酶溶液用于組織和單層細(xì)胞的解離。

胰酶分裝凍存時(shí)要注意什么？胰酶分裝時(shí)盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因?yàn)槔鋬霰４鏁r(shí)體積會(huì)膨脹，多次使用同一瓶胰酶反復(fù)凍融會(huì)降低消化效果并增大污染的可能性。5、怎么才能判斷胰酶消化完全？注意：不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才表示消化好了。一般肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動(dòng)了，多半呈沙狀移動(dòng)就可以了，就應(yīng)該停止消化。6、胰酶適用于哪些細(xì)胞消化？它的消化效果與哪些有關(guān)呢？胰酶適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織和傳代細(xì)胞，如胚胎、上皮、肝、腎等組織，但對(duì)纖維性組織和較硬的*組織效果較差。胰酶的消化效果主要與pH值、溫度、胰酶濃度、組織塊大小和硬度有關(guān)。

1、細(xì)胞培養(yǎng)過程中為什么要使用胰酶呢？胰酶的作用是什么？胰酶是一種蛋白酶，酶切位點(diǎn)是肽鏈的Lys或Arg兩個(gè)殘基的羧基端肽鏈，通過在特定位置上降解蛋白，使細(xì)胞膜上與培養(yǎng)皿壁結(jié)合處蛋白降解，從而使兩者分離。這時(shí)，細(xì)胞由于自身內(nèi)部細(xì)胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力可成為球形。圖1.胰酶酶切位點(diǎn)2、使用胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞，在使用胰酶消化時(shí)發(fā)現(xiàn)血清可以終止此過程，這是什么原因？血清終止的原理其實(shí)是競(jìng)爭(zhēng)抑制，就是用過量的牛血清中含有的蛋白和胰酶結(jié)合，使胰酶失去消化細(xì)胞蛋白的機(jī)會(huì)。3、為什么使用了胰蛋白酶消化，細(xì)胞還是成團(tuán)的，這可能是什么原因?qū)е碌模竣傧瘯r(shí)間不夠②吹打力度不夠③胰酶消化液濃度不夠④細(xì)胞密度過高之后才消化傳代⑤胰酶存儲(chǔ)不當(dāng)，或者使用了過期胰酶胰酶PH值6.8左右時(shí)呈淡黃色。

    (不含EDTA含酚紅)性質(zhì)、用途與生產(chǎn)工藝背景胰酶又名胰醇素、胰液素。白色或淡黃色無(wú)定形粉末。系從各種動(dòng)物胰臟制取的混合物，主要是蛋白酶、脂酶、淀粉酶。溶于水呈微渾溶液。不溶于醇、醚。有引濕性，遇酸、堿及熱即喪失活力，水溶液遇酸、熱、重金屬或單寧酸時(shí)產(chǎn)生沉淀。為助消化藥，用于缺乏胰液的***癥。也用于皮革工業(yè)和紡織印染，主要用于酶法脫毛。將絞碎的豬胰漿經(jīng)***、提取、沉淀、脫脂、干燥、粉碎而得。簡(jiǎn)介(不含EDTA含酚紅)為細(xì)胞培養(yǎng)基，1.不含EDTA含酚紅：含酚紅，（1：250）溶于HBSS溶液，不含鈣鎂。-20℃保存。胰(不含EDTA含酚紅)含，不含EDTA和酚紅，溶于無(wú)鈣鎂平衡鹽溶液中，經(jīng)過濾除菌，可以直接用于培養(yǎng)細(xì)胞和組織的消化，通常室溫消化2分鐘左右就消化下大多數(shù)貼壁細(xì)胞。使用方法(不含EDTA含酚紅)使用說明---貼壁細(xì)胞Chemicalbook的消化：a)吸去培養(yǎng)液，用無(wú)菌的PBS、Hanks液或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次，以去除殘余的血清。b)加入少量胰蛋白酶消化液，蓋過細(xì)胞即可，室溫放置1-2分鐘。不同的細(xì)胞消化時(shí)間有所不同，對(duì)于貼壁牢固的細(xì)胞可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。c)顯微鏡下觀察，細(xì)胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化。 胰蛋白酶水解或胰蛋白酶化是蛋白質(zhì)被胰蛋白酶消化或處理的過程，因此被稱為胰蛋白酶化。山東國(guó)產(chǎn)胰酶供應(yīng)商

適用于貼壁細(xì)胞的消化傳代；也可用于組織細(xì)胞分離的初步消化。浙江EDTA胰酶常見問題

    胰酶消化液(TrypsinSolution)操作步驟(一)獲得目的基因1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA***鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體1、胰酶消化液(TrypsinSolution)載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。(三)獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。2、測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。(四)誘導(dǎo)表達(dá)1、胰酶消化液(TrypsinSolution)挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。2、按1∶50比例稀釋過夜菌。 浙江EDTA胰酶常見問題