在體多光子顯微鏡

快速光柵掃描有多種實(shí)現(xiàn)方式，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描，將振鏡和可調(diào)電動(dòng)透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描，但可調(diào)電動(dòng)透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無(wú)法快速進(jìn)行焦點(diǎn)切換，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實(shí)現(xiàn)3D成像的手段，如圖2所示。在LSU模塊中，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過(guò)調(diào)控M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過(guò)調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來(lái)擴(kuò)大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無(wú)法快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡。多光子顯微鏡可以更好的了解神經(jīng)信號(hào)之間復(fù)雜動(dòng)態(tài)的編碼過(guò)程。在體多光子顯微鏡

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)極大地促進(jìn)了研究者們對(duì)于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識(shí)。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)[1]。想要將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來(lái)，通常需要對(duì)大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過(guò)增加激光強(qiáng)度來(lái)解決散射問(wèn)題，但這會(huì)帶來(lái)其他問(wèn)題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)作為激發(fā)光。美國(guó)bruker多光子顯微鏡數(shù)據(jù)處理目前中國(guó)顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等。

使用MPM對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行成像時(shí)，通過(guò)隨機(jī)訪問(wèn)掃描—即激光束在整個(gè)視場(chǎng)上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間。隨機(jī)訪問(wèn)掃描可以通過(guò)聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來(lái)實(shí)現(xiàn)，其原理是將具有一個(gè)射頻信號(hào)的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過(guò)光柵時(shí)發(fā)生衍射。通過(guò)射頻電信號(hào)調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向，這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描，利用1對(duì)AOD，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問(wèn)掃描。但是該技術(shù)對(duì)樣本的運(yùn)動(dòng)很敏感，易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影。目前，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動(dòng)偽影而被普遍的使用。

針對(duì)雙光子熒光顯微鏡的特點(diǎn)，從理論上分析雙光子成像特點(diǎn)，并搭建一套時(shí)間、空間分辨率高，能實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、多參數(shù)測(cè)量的雙光子熒光顯微鏡系統(tǒng)。具體系統(tǒng)應(yīng)實(shí)現(xiàn)∶（1）能對(duì)不同染料的雙光子熒光進(jìn)行探測(cè);（2）用特定染料對(duì)樣品標(biāo)記以后，能實(shí)現(xiàn)雙光子熒光的三維成像;（3）通過(guò)實(shí)驗(yàn)的研究，改進(jìn)雙光子熒光顯微成像系統(tǒng);（4）在保證成像質(zhì)量的前提下，簡(jiǎn)化整個(gè)系統(tǒng)，使得實(shí)驗(yàn)操作方便、安全。單光子激發(fā)熒光的過(guò)程，就是熒光分子吸收一個(gè)光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后，能量較大的激發(fā)態(tài)分子，通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí)。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí)像在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像研究中顯示了較大的優(yōu)勢(shì)。而在顯微成像中，雙光子熒光顯微鏡憑其獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn)，成為研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能檢測(cè)的重要工具。世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國(guó)和日本，德國(guó)是徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司。

2020年，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圓柱透鏡將激光束一維聚焦，會(huì)聚角為Δθ。光束進(jìn)入到一對(duì)幾乎平行的高反射鏡中，其間距為S，偏角為α。經(jīng)過(guò)反射鏡多次反射后，激光脈沖被分成多個(gè)傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α），脈沖間以2S/c的時(shí)間延遲（c，光速）回射。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過(guò)FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。中國(guó)市場(chǎng)多光子顯微鏡進(jìn)出口貿(mào)易趨勢(shì)。bruker多光子顯微鏡方案

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。在體多光子顯微鏡

細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)，隨著刺激時(shí)間的增長(zhǎng)，即使刺激繼續(xù)存在，Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng)，反而會(huì)減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平。對(duì)于細(xì)胞受精過(guò)程中 Ca2+熒光信號(hào)的變化情況，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過(guò)程中，Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化，而配子之間發(fā)生融合作用時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象，對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及 Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過(guò)程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過(guò)程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很的變化。在體多光子顯微鏡