熒光多光子顯微鏡原理

    多光子顯微鏡因擁有較深的成像深度，和較高的對(duì)比度在生物成像中有著重要的意義，但是它通常需要較高的功率。結(jié)合時(shí)間上展開的超短脈沖可以實(shí)現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度，但是其本身所利用的近紅外波段的光會(huì)導(dǎo)致分辨率較低。清華大學(xué)陳宏偉教授和北京大學(xué)席鵬研究員合作研究，結(jié)合了結(jié)構(gòu)光成像和上轉(zhuǎn)化粒子，開發(fā)了一種基于多光子上轉(zhuǎn)化材料和時(shí)間編碼結(jié)構(gòu)光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM)。它可以實(shí)現(xiàn)50MHz的超高的掃描速度，并突破了衍射極限，實(shí)現(xiàn)了超分辨成像。相較于普通的熒光顯微鏡，該顯微鏡提升了，并且只需要較低的激發(fā)功率。這種超快、低功率、多光子的超分辨技術(shù)，在分辨率高的生物深層組織成像上有著長遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。 多光子共聚焦掃描顯微鏡比雙光子共聚焦掃描顯微鏡具有更高的空間分辨率。熒光多光子顯微鏡原理

    基于多光子顯微鏡的神經(jīng)成像技術(shù)原理：多光子顯微鏡可用于深度成像和三維成像，因此可用于拍攝不透明的厚樣品。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡。雙光子顯微鏡的結(jié)構(gòu)與共焦類似，區(qū)別在于：1)雙光子顯微鏡的激發(fā)光波長比共焦長，能量較低，但穿透能力較強(qiáng)；2)雙光子顯微鏡沒有小孔，提高了檢測效率；3)雙光子顯微鏡成像深度較快提高。那么，為什么雙光子能具有共焦顯微鏡所沒有的優(yōu)勢呢？原因是它采用雙光子激發(fā)方式。使用波長較長的激發(fā)光子，光子的能量較低，因此電子需要吸收兩個(gè)這樣的激發(fā)光子才能達(dá)到激發(fā)態(tài)，從而釋放出一個(gè)熒光光子。因此，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與光強(qiáng)的平方成正比。因?yàn)榻裹c(diǎn)處的光強(qiáng)較大，只能在焦點(diǎn)處激發(fā)熒光。波長越長，穿透力越強(qiáng)，因此雙光子顯微鏡的成像深度大于共焦顯微鏡。由于兩個(gè)光子只在焦點(diǎn)激發(fā)熒光，不需要小孔，而是將所有的熒光都收集起來，提高了檢測效率。三光子顯微鏡的原理類似于雙光子顯微鏡，利用三個(gè)激發(fā)光子可以實(shí)現(xiàn)更深的成像深度。由于使用了更長的激發(fā)波長，穿透能力更強(qiáng)，成像深度更大。此外，由于較強(qiáng)的非線性效應(yīng)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與光強(qiáng)的立方成正比，因此比雙光子具有更低的非聚焦激發(fā)和背景噪聲。 Ultima Investigator多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析未來國產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡替代空間大。

我們要指出的是，單光子激發(fā)熒光和雙光子激發(fā)熒光，是從熒光產(chǎn)生的機(jī)理上來區(qū)分的。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結(jié)構(gòu)，其目的是為了，通過共焦結(jié)構(gòu)，提高整個(gè)熒光顯微鏡的空間分辨率。所以共焦熒光顯微鏡可以根據(jù)激發(fā)光源的不同，實(shí)現(xiàn)單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像。往往一個(gè)普通的雙光子熒光顯微鏡（沒有共焦結(jié)構(gòu)）其空間分辨率也可以達(dá)到單光子共焦熒光顯微鏡的水平。這樣就可以簡化整個(gè)系統(tǒng)，相對(duì)來說，就提高了激發(fā)光源的利用率，以及熒光的探測效率，這個(gè)也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應(yīng)和共焦結(jié)構(gòu)，分辨率則會(huì)更高，而我們通常說的共焦顯微鏡都是指單光子激發(fā)熒光的。

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個(gè)優(yōu)勢極大地促進(jìn)了研究者們對(duì)于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識(shí)。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)[1]。想要將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來，通常需要對(duì)大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來解決散射問題，但這會(huì)帶來其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光。多光子顯微鏡將生物打印結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位和定向到特定的解剖部位，使其能夠在小鼠組織內(nèi)制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)。

2020年，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圓柱透鏡將激光束一維聚焦，會(huì)聚角為Δθ。光束進(jìn)入到一對(duì)幾乎平行的高反射鏡中，其間距為S，偏角為α。經(jīng)過反射鏡多次反射后，激光脈沖被分成多個(gè)傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α），脈沖間以2S/c的時(shí)間延遲（c，光速）回射。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。多光子顯微鏡銷售渠道分析及建議。美國共聚焦多光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)

點(diǎn)掃描多光子顯微鏡可以深入樣本并捕捉高質(zhì)量的圖像，但這個(gè)過程極其緩慢，因?yàn)閳D像是一次形成一個(gè)點(diǎn)。熒光多光子顯微鏡原理

多光子激光掃描顯微鏡行業(yè)發(fā)展，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國和日本，德國是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為，而日本以尼康和奧林巴斯公司為，2020年，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場 64.44%的市場份額，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向。目前世界市場對(duì)多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長，中國市場這方面的需求增長更快，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將具有很大的發(fā)展?jié)摿?。熒光多光子顯微鏡原理