上海北京細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2024-06-28

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的方法有哪些:1.電穿孔法。通過短暫的高電場(chǎng)電脈沖處理細(xì)胞,沿細(xì)胞膜的電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的暫時(shí)穿孔。DNA被認(rèn)為是穿過孔擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)的。電脈沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要,因?yàn)檫^高的場(chǎng)強(qiáng)和過長(zhǎng)的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。理論上說(shuō)電穿孔法可用于各種細(xì)胞,且不需要另外采購(gòu)特殊試劑,但需要昂貴的電轉(zhuǎn)儀。此法每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA,因?yàn)榧?xì)胞的死亡率高。每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化。2.細(xì)菌介導(dǎo)的傳染。傳染需要將目的基因克隆到特定的細(xì)菌體系中,經(jīng)過包裝細(xì)胞的包裝得到改造后的細(xì)菌,再進(jìn)行傳染。優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率特別高,尤其是難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞、細(xì)胞。缺點(diǎn)是構(gòu)建細(xì)菌周期長(zhǎng),環(huán)節(jié)多,易出錯(cuò),費(fèi)用也高脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中。上海北京細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作方法:轉(zhuǎn)染,是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入,轉(zhuǎn)染目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因?qū)儆谕ㄟ^物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例;化學(xué)介導(dǎo)方法很多,如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù);生物介導(dǎo)方法,有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,和現(xiàn)在比較多見的各種細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法,應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),是目前轉(zhuǎn)染效率較高的方法,同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì)。但是,細(xì)菌轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜,常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性,在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,則各有其特點(diǎn)石家莊正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(很長(zhǎng)轉(zhuǎn)染)。

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染那些事兒:1.選擇傳代次數(shù)較低并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞而言,均需要在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前現(xiàn)在鋪板,第二天上午進(jìn)行轉(zhuǎn)染,48h后收集細(xì)胞進(jìn)行功能檢測(cè)。對(duì)于原代細(xì)胞,可用促有絲分裂刺激物進(jìn)行細(xì)胞活化。2.對(duì)于貼壁細(xì)胞,一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,用胰酶處理為單細(xì)胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,較好在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一次新鮮培養(yǎng)液。3.支原體污染會(huì)嚴(yán)重降低細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率,且支原體不會(huì)像細(xì)菌污染那么明顯,因而轉(zhuǎn)染前可用環(huán)丙沙星處理細(xì)胞以除去支原體。

影響轉(zhuǎn)染試驗(yàn)的因素:細(xì)胞狀態(tài)變化:(1)轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞不匹配細(xì)胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細(xì)胞,也不是傳代很多次的細(xì)胞。這是因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,較容易轉(zhuǎn)染。(2)把握時(shí)機(jī)沒錯(cuò)!轉(zhuǎn)染也有適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī),相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA。因此對(duì)大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言,細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前現(xiàn)在種板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)不應(yīng)處于過度生長(zhǎng)的狀態(tài),如細(xì)胞數(shù)量過多,互相疊加,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗竭,代謝廢物積聚,轉(zhuǎn)染率低下也是很正常的!對(duì)于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的較佳陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑的量會(huì)因細(xì)胞密度而異。

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染,你至少要掌握以下幾點(diǎn):胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA,RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展,轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)中,其應(yīng)用越來(lái)越普遍。可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染等。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是指外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個(gè)宿主細(xì)胞可存在多個(gè)拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動(dòng)子和其他調(diào)控元件的分析。一般來(lái)說(shuō),超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高,在轉(zhuǎn)染后24-72h內(nèi)分析結(jié)果,常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測(cè)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小,通常需要一些選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷。太原正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家好

這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。上海北京細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞轉(zhuǎn)染那些事兒:1.設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照:一般在轉(zhuǎn)染后24-48h,靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)??梢罁?jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。2.轉(zhuǎn)染后效率的檢測(cè)方法:觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光情況;qPCR驗(yàn)證;WB檢測(cè)敲減或過表達(dá)蛋白。3.轉(zhuǎn)染效率低,可采取以下兩種方法:1)復(fù)轉(zhuǎn)染,即轉(zhuǎn)染后12-24h再進(jìn)行轉(zhuǎn)染,前提是該細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的耐受性較好,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡數(shù)較少。2)通過藥篩來(lái)殺死未轉(zhuǎn)入成功的細(xì)胞,前提是該質(zhì)粒帶有物品抗性的基因。4.電轉(zhuǎn)時(shí),不同的細(xì)胞需要的電壓是不一樣的,需要做預(yù)實(shí)驗(yàn),摸索較佳條件。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞而言,較佳電壓位于250-1250v/cm。電擊后,應(yīng)該將DNA和細(xì)胞混合液在室溫下放置10min,使細(xì)胞恢復(fù)損傷。上海北京細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑