上海細胞支原體預防

來源： 發(fā)布時間：2024-06-09

qPCR法，即定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Quantitative Polymerase Chain Reaction）法，是一種高度靈敏和特異的分子生物學技術(shù)，用于檢測和定量DNA序列。在支原體檢測中，qPCR法的原理主要包括以下幾個步驟：
1. DNA提?。菏紫葟拇郎y樣本中提取DNA，這可能包括細胞培養(yǎng)上清液或組織樣本中的支原體DNA。
2. 設(shè)計特異性引物：針對支原體的保守DNA序列，如16S rRNA基因，設(shè)計特異性的DNA引物。
3. 熒光標記探針：使用熒光標記的探針，該探針與目標DNA序列互補，能夠在PCR擴增過程中與擴增的DNA結(jié)合。
4. Ct值確定：Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）是指在PCR反應(yīng)中，熒光信號強度超過預定閾值的循環(huán)次數(shù)。Ct值越低，表示樣本中支原體DNA的量越多。
5. 定量分析：通過標準曲線法或相對定量法，將Ct值轉(zhuǎn)換為支原體DNA的定量結(jié)果。
qPCR法的優(yōu)勢在于其高靈敏度和特異性，能夠檢測到非常低水平的支原體污染，并且可以在短時間內(nèi)提供結(jié)果，這對于需要快速檢測的生物制品生產(chǎn)和細胞培養(yǎng)質(zhì)量控制非常重要
支原體及污染方式有哪些？上海細胞支原體預防

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在科研中，支原體檢測是確保細胞培養(yǎng)純凈性的重要環(huán)節(jié)。以下是一些在科研中常見的支原體檢測方法：
1. 支原體培養(yǎng)法：這是一種傳統(tǒng)的檢測方法，通過將細胞培養(yǎng)物接種到特定的培養(yǎng)基中，觀察是否有支原體生長。這是直接的檢測方法，但耗時較長，通常需要數(shù)周時間。
2. DNA染色法：使用熒光染料（如Hoechst或DAPI）染色細胞核，然后通過熒光顯微鏡觀察。這種方法操作簡便，可以快速得到結(jié)果，但特異性不高，可能會有假陽性。
3. 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法：這是一種分子生物學技術(shù)，通過設(shè)計特異性的引物，擴增支原體DNA，從而檢測支原體的存在。PCR法具有高靈敏度和特異性，已成為日常細胞培養(yǎng)維護的可靠方法。
4. 核酸擴增技術(shù)（NAT）：NAT技術(shù)通過擴增并檢測特定的支原體基因組保守序列來進行支原體污染檢測，具有快速、簡便的特點。
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支原體污染一旦發(fā)生，不僅對細胞培養(yǎng)造成嚴重影響，甚至可能導致實驗結(jié)果失真。而且支原體污染在細胞培養(yǎng)實驗中相當常見。因此，預防措施是確保細胞培養(yǎng)環(huán)境和實驗結(jié)果可靠性的重要手段。
01/ 良好的無菌技術(shù)及實驗操作，保證操作不會引入新的污染
02/ 保持實驗空間的清潔
03/ 確保從可靠的來源獲取細胞，減少不同細胞之間的交叉?zhèn)魅?/span>
04/ 防止交叉污染
05/ 減少氣溶膠生成
06/ 謹慎使用抗*素
07/ 定期支原體篩查
08/ 丟棄或處理受到支原體污染的細胞
09/ 保持良好的記錄

細胞培養(yǎng)中，需要去除支原體的污染：支原體污染是細胞培養(yǎng)中 普遍的問題之一，細胞庫中或正在使用的細胞中，支原體的污染率約為15%-35%。并對培養(yǎng)細胞的生理和代謝造成諸多影響：
01/ 爭奪營養(yǎng) – 阻礙細胞生長和增殖 
02/ 改變蛋白質(zhì)、RNA 或 DNA 合成的水平 
03/ 改變基因表達、細胞信號傳導和形態(tài) 
04/ 損害膜和細胞器 
05/ 導致突變和染色體變化 
06/ 時間、金錢和有價值的細胞丟失，耽誤研究時間
07/ 實驗結(jié)果的不可靠性，實驗結(jié)果的重復性 降低
08/ 生物安全問題
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支原體去除的原理通常涉及以下幾個方面：
1. 抗*素作用：使用特定的抗*素制劑來抑制支原體的生長和繁殖。例如，含有喹諾酮類、四環(huán)素衍生物類和大環(huán)內(nèi)酯類抗*素的混合制劑，這些抗*素能夠抑制支原體的DNA和蛋白合成。
2. 破壞細胞膜：支原體去除劑中的抑菌肽（AMPs）成分通過破壞支原體細胞膜的完整性，導致支原體細胞死亡。
3. 抑制DNA復制：支原體去除劑通過抑制支原體DNA回旋酶活性，有效抑制支原體DNA的復制，從遺傳物質(zhì)著手徹底殺滅支原體。
4. 協(xié)同作用：某些支原體去除劑利用抑菌肽（AMPs）和穿膜肽（CPPs）的協(xié)同作用來除去支原體，穿膜肽能夠幫助抑菌肽更有效地穿透細胞膜，增強其殺滅支原體的能力。

支原體檢測的樣本用什么合適？上海細胞支原體預防

細胞培養(yǎng)中，支原體檢測的重要性？上海細胞支原體預防

細胞培養(yǎng)過程中如果發(fā)現(xiàn)支原體污染，可以采取以下一些方法嘗試去除污染：

1. 抗*素治*：使用針對支原體有效的抗*素，如四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類等。根據(jù)搜索結(jié)果，可以加入高濃度抗*素進行沖擊治*，例如慶大霉素 200ug/ml，四環(huán)素10ug/ml，卡那霉素50ug/ml，并維持24-48小時后再換入常規(guī)培養(yǎng)液。
2. 加溫處理：支原體不耐熱，可以將細胞置于41°C中處理5-10小時以殺滅支原體。但需注意，高溫也可能對細胞造成傷害，因此需要預先確定對細胞影響較小的處理時間。
3. 使用支原體清除劑：市場上有專門的支原體清除劑，按照產(chǎn)品說明使用。
4. 使用支原體清*培養(yǎng)基：如Procell支原體清*培養(yǎng)基，這類產(chǎn)品含有清*支原體的特殊成分，可以抑制支原體生長并挽救珍貴細胞。
5. 物理方法：一些實驗室采用過濾的方法，使用0.22μm或更小孔徑的濾膜過濾培養(yǎng)基和試劑，以阻止支原體的侵入。
6. 細胞傳代：在一些情況下，通過細胞傳代可能有助于減少支原體的污染程度。
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