其他熒光物質(zhì):酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,后者可發(fā)出熒光,激發(fā)光波長為360nm,發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪(Eu3)、鋱(Tb3)、鈰(Ce3)等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,其中以Eu3應(yīng)用較廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,發(fā)射光波長范圍窄,熒光衰變時間長,較適合用于分辨熒光免疫測定。免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。CTNT免疫熒光分析
細(xì)胞免疫熒光簡單實(shí)驗步驟如下:1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈:3min×3。4. 1%Triton:25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈:2×5 min。6. 羊血清封閉:37度,20分鐘。7. 一抗,4度過夜,一般要大于18小時或者37度,1-2小時。8. 4度PBS洗凈,3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈,3×5 min。11. 涼干封片(封閉液PH8.5);不管采用何種方法,在使用PBS緩沖液漂洗時,都要漂洗干凈并且要測下pH值,可以使用PBS多清洗幾次,也可以延長PBS清洗時間,如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。CTNT免疫熒光分析免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。
熒光效率:熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率,與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率=發(fā)射熒光的光量分子數(shù)(熒光強(qiáng)度)/吸收光的光量子數(shù)(激發(fā)光強(qiáng)度)。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度,除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外,也與激發(fā)光的波長有關(guān)。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜(熒光光譜),即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長,且測定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時,得到的熒光強(qiáng)度也較大。
細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗注意事項:根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段,則不需要通透;一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果;從加熒光二抗起,后面所有操作步驟盡量避光??s短在熒光顯微鏡下的觀察時間,1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色:烤片溫度過高,推薦 56~60 ℃ 1~2 h;一抗是否適用固定液和石蠟切片,使用濃度是否過低,孵育是否時間過短等。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。
熒光色素:四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)結(jié)構(gòu)式如下:較大吸引光波長為550nm,較大發(fā)射光波長為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)用于顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì)。PCNA免疫檢測
免疫熒光技術(shù)可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號,從而確定目標(biāo)分子的存在和位置。CTNT免疫熒光分析
熒光素標(biāo)記抗體的方法:方法及步驟:①抗體的準(zhǔn)備:取適量已知球蛋白濃度之溶液,置入三角燒瓶中,加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,使然后蛋白濃度為20mg/ml,緩沖液容量為總量的1/10,混勻,將三角燒瓶置冰槽中,電磁攪拌(速度適當(dāng)以不起泡沫為宜)5~10min。②熒光素的準(zhǔn)備:根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量,按每毫克蛋白加0.01mg熒光素,用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結(jié)合(或稱標(biāo)記):邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上(大約5~10min內(nèi)加完),加畢后,繼續(xù)攪拌12~18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,故須及時添冰去水;亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中。CTNT免疫熒光分析