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細(xì)胞的固定及免疫熒光:1)吸除培養(yǎng)基,一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次,每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,進(jìn)行細(xì)胞固定,室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,目的是使細(xì)胞通透。5) 除去Triton X-100,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(shí)(選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致)。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液,向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗(一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度,后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以摸索抗體的適宜濃度),4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。VEGF免疫組化IHC
免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟:細(xì)胞爬片免疫熒光:在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;(圓蓋片:13mm24孔;18mm12孔;20mm6孔)用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA(PBS配置),室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。MMP9免疫抗體免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制和醫(yī)治效果評估。
熒光抗體技術(shù):抗原抗體反應(yīng)后,利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。免疫熒光測定:抗原抗體反應(yīng)后,利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟:直接法測抗原:基本原理:將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低;而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
免疫熒光通過抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng),進(jìn)而對抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出,熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光,可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,利用定量技術(shù)測定含量,從而可對抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析。細(xì)胞免疫熒光用途:快速直觀顯示所檢測蛋白的細(xì)胞定位。材料與儀器:樣品:貼壁細(xì)胞;試劑:4% 組織固定液,PBS,Triton X-100,BSA,熒光二抗,免疫熒光染色二抗稀釋液,抗熒光猝滅封片液,0.25% 胰酶;器材:6/12/24 孔板,細(xì)胞爬片(蓋玻片),載玻片,15 ml 離心管。免疫熒光技術(shù)可以通過熒光信號顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì)。
免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng):為了保證熒光染色的正確性,初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對照,以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對照:標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。②特異性對照(抑制試驗(yàn)):標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽性對照:已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,陽性對照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,則為特異性陽性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min,就有熒光減弱現(xiàn)象,經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察,隨著時(shí)間的延長,熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達(dá)調(diào)控。MMP9免疫抗體
熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。VEGF免疫組化IHC
免疫熒光間接法測抗體實(shí)驗(yàn)步驟:滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片,10min后棄去,使標(biāo)本片保持一定濕度。滴加以0.01mol/L,pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫30min。取出玻片,置于玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗1-2次,然后按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸5min,不時(shí)振蕩。取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標(biāo)本干燥,滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫30min。重復(fù)操作3。取出玻片,用濾紙吸去多余水分,滴加一滴緩沖甘油,再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察,結(jié)果判定同直接法。VEGF免疫組化IHC