COL-2免疫熒光檢查

來源: 發(fā)布時間:2024-04-21

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見問題:1、信號弱或者無信號:細(xì)胞或組織樣本保存時間過長;2)抗體濃度不合適,參照抗體說明書的稀釋濃度,再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索;3)一抗孵育時間不合適,建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景:封閉不充分;抗體濃度過高;抗體孵育時間過長或溫度過高;清洗不充分;樣本變干,染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多:固定液殘留,這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸,并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色;二抗殘留,二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大,那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。COL-2免疫熒光檢查

COL-2免疫熒光檢查,免疫

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致:1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,PBS洗三遍。注意:有的時候作的細(xì)胞爬片可能比較小,因此夾取的時候要小心,注意 反正面,放在皿里洗比較方便,避免了來回夾取,另外洗的時候加PBS不要太沖,不要細(xì)胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉,沒有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘,PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜,也可37度2小時,感覺前者效果好,PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(避光),或者37度1半小時,PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核,然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒桑圆挥弥讣子头獾脑挄囊凰俊?a href="http://scfyhd.cn/zdcbsx/9gfs819qev/22368494.html" target="_blank">COL-2免疫熒光檢查免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期。

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免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種.它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1、建議細(xì)胞直接種孔板,采用倒置熒光顯微鏡拍照,這樣可以避免然后挑片時造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果;2、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡,則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片。建議直接購買處理過的細(xì)胞爬片;若只有普通細(xì)胞爬片,可以先將爬片于濃酸(濃酸腐蝕性強(qiáng),注意操作)或 75% 乙醇浸泡過夜,若用酸浸泡過夜,第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液,若用 75% 乙醇浸泡,則不需要此步驟。然后,用洗潔精搓洗爬片,然后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干,再將爬片置于超凈臺造紫外消毒后備用。熒光抗體技術(shù)可用于檢測和定位各種抗原,也可以用于檢測和定位抗體。

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免疫熒光通透(目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)),0.5%TritonX-100(一種去垢劑,用PBS配制)室溫通透20min(針對胞內(nèi)抗原,若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則省略該步驟);除了TritonX-100,也可作為通透劑,并且固定后的樣品不需要通透。封閉(減少一抗和二抗與非特異位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合),通透后用PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加山羊血清,室溫封閉30min。常用的封閉液包括:與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟,一定要注意樣品的保濕,避免樣品的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景。醛類固定的樣品,在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進(jìn)行封閉。免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原的技術(shù)。COL-2免疫熒光檢查

免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。COL-2免疫熒光檢查

熒光色素:四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)結(jié)構(gòu)式如下:較大吸引光波長為550nm,較大發(fā)射光波長為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。COL-2免疫熒光檢查