MYeloperoxidase免疫熒光試驗(yàn)

來源: 發(fā)布時(shí)間:2024-03-24

熒光素標(biāo)記抗體的方法:方法及步驟:①抗體的準(zhǔn)備:取適量已知球蛋白濃度之溶液,置入三角燒瓶中,加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,使然后蛋白濃度為20mg/ml,緩沖液容量為總量的1/10,混勻,將三角燒瓶置冰槽中,電磁攪拌(速度適當(dāng)以不起泡沫為宜)5~10min。②熒光素的準(zhǔn)備:根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量,按每毫克蛋白加0.01mg熒光素,用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結(jié)合(或稱標(biāo)記):邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上(大約5~10min內(nèi)加完),加畢后,繼續(xù)攪拌12~18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,故須及時(shí)添冰去水;亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫(kù)中。免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景。MYeloperoxidase免疫熒光試驗(yàn)

MYeloperoxidase免疫熒光試驗(yàn),免疫

熒光的產(chǎn)生:一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量(如光能、化學(xué)能等)而進(jìn)入激發(fā)態(tài),當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí),過剩的能量可以電磁輻射的形式放射(即發(fā)光)。熒光發(fā)射的特點(diǎn)是:可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光;而一旦停止供能,發(fā)光(熒光)現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失??梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多,由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光,由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。ucp2免疫免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。

MYeloperoxidase免疫熒光試驗(yàn),免疫

熒光色素:四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)結(jié)構(gòu)式如下:較大吸引光波長(zhǎng)為550nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧F洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合,但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1、建議細(xì)胞直接種孔板,采用倒置熒光顯微鏡拍照,這樣可以避免然后挑片時(shí)造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果;2、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡,則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片。建議直接購(gòu)買處理過的細(xì)胞爬片;若只有普通細(xì)胞爬片,可以先將爬片于濃酸(濃酸腐蝕性強(qiáng),注意操作)或 75% 乙醇浸泡過夜,若用酸浸泡過夜,第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液,若用 75% 乙醇浸泡,則不需要此步驟。然后,用洗潔精搓洗爬片,然后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干,再將爬片置于超凈臺(tái)造紫外消毒后備用。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用。

MYeloperoxidase免疫熒光試驗(yàn),免疫

細(xì)胞的固定及免疫熒光:注意事項(xiàng):(1)取細(xì)胞爬片時(shí),動(dòng)作應(yīng)輕柔,防止將細(xì)胞爬片夾碎,影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。(2)種細(xì)胞過程中,要注意將細(xì)胞輕柔混勻,“八”字或者“十”字形搖晃,防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過密。(3)稀釋、加二抗(熒光抗體)及此后的洗滌過程中注意避光。(4)細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后,需要盡快拍照,防止免疫熒光淬滅?;蛘叻庞诎岛袃?nèi),暫時(shí)保存于4度冰箱,盡快拍照。(5)在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí),要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色,只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),用于檢測(cè)和定位特定抗原或抗體。COX2免疫組化IHC

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。MYeloperoxidase免疫熒光試驗(yàn)

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種.它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)MYeloperoxidase免疫熒光試驗(yàn)