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熒光物質(zhì),熒光色素:許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有:⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,較大吸收光波長為490--495nm,較大發(fā)射光波長520--530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,結(jié)構(gòu)式如下:有兩種同分異結(jié)構(gòu),其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,在冷暗干燥處可保存多年,是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是:①人眼對(duì)黃綠色較為敏感,②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下:較大吸收光波長為570nm,較大發(fā)射光波長為595~600nm,呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下:較大吸引光波長為550nm,較大發(fā)射光波長為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病。COX2免疫抗體
免疫熒光固定(防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散),固定液包括:有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇等);交聯(lián)劑(4%PFA、10%中性福爾馬林),固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性,不過,目前甲醛用的還是較多的,但針對(duì)磷酸化的抗體,不適合用甲醛,會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,故應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇,同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā),在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久。固定時(shí)間:取決于組合塊的大小和類型,對(duì)于大多數(shù)組織,18-24h較為理想,細(xì)胞固定時(shí)間較短,一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細(xì)胞樣品為例:用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min。CK7免疫熒光檢查免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。
免疫熒光檢測相對(duì)于酶檢測的優(yōu)勢:定量熒光信號(hào)的能力(與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測定相反);復(fù)用能力(可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì));熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色),可以看見熒光所在的組織細(xì)胞,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術(shù)測定含量。
其他熒光物質(zhì):1.酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,后者可發(fā)出熒光,激發(fā)光波長為360nm,發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等。2.鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪(Eu3+)、鋱(Tb3+)、鈰(Ce3+)等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,發(fā)射光波長范圍窄,熒光衰變時(shí)間長,較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器:熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀和時(shí)間分辨熒光計(jì)等儀器激光共聚焦顯微鏡。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用。
zo-1的免疫熒光,步驟如下:1.細(xì)胞在蓋片上生長融合到95%-100%時(shí),從孵箱中取出。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次,每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。4.1×PBS洗3次,每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘。6.1×PBS洗3次,每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘。8.加一抗(用1%BSA稀釋)放在濕盒里,4度過夜。9.1×PBS洗3次,每次10分鐘。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘,閉光。11.1×PBS洗3次,每次10分鐘。12.95%甘油封片。注:4%甲醛,0.2%Triton,5%BSA均用1×PBS稀釋。免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用,可以用于檢測病原體、肉瘤標(biāo)志物等。col-10(COL-X)免疫熒光試驗(yàn)
免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。COX2免疫抗體
細(xì)胞和組織樣品處理:準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品:為實(shí)現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量,首先應(yīng)建立針對(duì)目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究,同時(shí)將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定,然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部,標(biāo)記目的靶點(diǎn)。封閉細(xì)胞樣品,防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合,較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色??贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合,而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。COX2免疫抗體