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細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):非特異性染色:是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;孵育過(guò)程中干片;抗原熱修復(fù)過(guò)度。染色過(guò)深:一抗?jié)舛冗^(guò)高;染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng);染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透,但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白,可先通透再固定,這樣可以通過(guò)通透去除一些水溶性蛋白,進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào);建議設(shè)陰性對(duì)照組,消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色;選擇醛類固定液時(shí),保持其新鮮度,較好現(xiàn)配現(xiàn)用,使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。熒光抗體技術(shù)可以用于檢測(cè)和定位細(xì)胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。COL-1免疫熒光IF
熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍;與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比,成本較低。間接免疫熒光的缺點(diǎn):由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,因此物種交叉反應(yīng)性問(wèn)題增加;與直接免疫熒光相比,時(shí)間更長(zhǎng)(操作步驟更多)。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn):通過(guò)增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大;與直接免疫熒光相比,通過(guò)信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度;熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍;與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比,成本較低。間接免疫熒光的缺點(diǎn):由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,因此物種交叉反應(yīng)性問(wèn)題增加;與直接免疫熒光相比,時(shí)間更長(zhǎng)(操作步驟更多)。INOS免疫熒光免疫熒光技術(shù)通過(guò)熒光信號(hào)的觀察來(lái)確定抗原或抗體的分布和定位。
其他熒光物質(zhì):酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng),一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,后者可發(fā)出熒光,激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪(Eu3)、鋱(Tb3)、鈰(Ce3)等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,其中以Eu3應(yīng)用較廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬,發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄,熒光衰變時(shí)間長(zhǎng),較適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。
免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種.它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展,該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答。
細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致:1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,PBS洗三遍。注意:有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小,因此夾取的時(shí)候要小心,注意 反正面,放在皿里洗比較方便,避免了來(lái)回夾取,另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖,不要細(xì)胞沖下來(lái)。洗的時(shí)候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉,沒(méi)有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘,PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過(guò)夜,也可37度2小時(shí),感覺(jué)前者效果好,PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光),或者37度1半小時(shí),PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核,然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因?yàn)楦视筒幌髽?shù)脂那樣會(huì)干,所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點(diǎn)和作用機(jī)制。CTNT免疫熒光試驗(yàn)
免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常。COL-1免疫熒光IF
熒光色素:四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)結(jié)構(gòu)式如下:較大吸引光波長(zhǎng)為550nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧F洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合,但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。COL-1免疫熒光IF