細(xì)胞免疫熒光實驗注意事項:根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段,則不需要通透;一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果;從加熒光二抗起,后面所有操作步驟盡量避光??s短在熒光顯微鏡下的觀察時間,1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色:烤片溫度過高,推薦 56~60 ℃ 1~2 h;一抗是否適用固定液和石蠟切片,使用濃度是否過低,孵育是否時間過短等。在1941年,Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實驗。BMP2免疫熒光染色
細(xì)胞免疫熒光實驗常見問題:1、信號弱或者無信號:細(xì)胞或組織樣本保存時間過長;2)抗體濃度不合適,參照抗體說明書的稀釋濃度,再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索;3)一抗孵育時間不合適,建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景:封閉不充分;抗體濃度過高;抗體孵育時間過長或溫度過高;清洗不充分;樣本變干,染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多:固定液殘留,這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸,并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色;二抗殘留,二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大,那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。BMP2免疫熒光染色熒光抗體技術(shù)可以用于檢測和定位細(xì)胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。
細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中,需要用到細(xì)胞爬片,通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),細(xì)胞在爬片上生長,進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。實驗前準(zhǔn)備:1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點:通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號放大;與直接免疫熒光相比,通過信號放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。
熒光色素:異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,F(xiàn)ITC)為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,較大吸收光波長為490495nm,較大發(fā)射光波長520530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,結(jié)構(gòu)式如下:有兩種同分異結(jié)構(gòu),其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,在冷暗干燥處可保存多年,是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點是:①人眼對黃綠色較為敏感,②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明(rhodamine,RIB200)為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下:較大吸收光波長為570nm,較大發(fā)射光波長為595~600nm,呈橘紅色熒光。在實際工作中,熒光抗原技術(shù)應(yīng)用較少,因此通常將其稱為熒光抗體技術(shù)或免疫熒光技術(shù)。
免疫熒光的原理和類型:免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長(分子的吸收光譜)下吸收光子的特性,經(jīng)過短暫的間隔(發(fā)射光譜)后以較高的波長發(fā)射光子,并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到。熒光團(tuán)可以通過可見光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買,其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍。它們不會損傷活細(xì)胞,可安全用于生物制劑。在進(jìn)行免疫熒光檢測時,首先對細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理。進(jìn)行免疫染色時,熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合,然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴(kuò)增,免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。免疫熒光技術(shù)可以用于研究動物模型和藥物篩選。IL-6免疫熒光
免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病。BMP2免疫熒光染色
細(xì)胞免疫熒光簡單實驗步驟如下:1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈:3min×3。4. 1%Triton:25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈:2×5 min。6. 羊血清封閉:37度,20分鐘。7. 一抗,4度過夜,一般要大于18小時或者37度,1-2小時。8. 4度PBS洗凈,3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈,3×5 min。11. 涼干封片(封閉液PH8.5);不管采用何種方法,在使用PBS緩沖液漂洗時,都要漂洗干凈并且要測下pH值,可以使用PBS多清洗幾次,也可以延長PBS清洗時間,如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。BMP2免疫熒光染色