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細(xì)胞的固定及免疫熒光:注意事項(xiàng):(1)取細(xì)胞爬片時(shí),動(dòng)作應(yīng)輕柔,防止將細(xì)胞爬片夾碎,影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。(2)種細(xì)胞過程中,要注意將細(xì)胞輕柔混勻,“八”字或者“十”字形搖晃,防止細(xì)胞局部生長過密。(3)稀釋、加二抗(熒光抗體)及此后的洗滌過程中注意避光。(4)細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后,需要盡快拍照,防止免疫熒光淬滅?;蛘叻庞诎岛袃?nèi),暫時(shí)保存于4度冰箱,盡快拍照。(5)在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí),要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色,只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達(dá)調(diào)控。CD36免疫熒光
基于熒光成像的技術(shù)對(duì)于查詢細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用。當(dāng)與免疫化學(xué)結(jié)合時(shí),熒光成像技術(shù)的分析能力增加,增強(qiáng)了這種技術(shù)在普遍的研究和臨床應(yīng)用中的實(shí)用性,使其成為寶貴的工具。免疫熒光顯微鏡通過使活細(xì)胞成像能夠可視化整個(gè)細(xì)胞器,徹底改變了細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進(jìn)行細(xì)胞分析的常用熒光成像技術(shù)。免疫熒光(IF)是一種強(qiáng)大的免疫染色技術(shù),利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標(biāo)分子結(jié)合的熒光素標(biāo)記抗體。免疫熒光用于鑒定細(xì)胞中的細(xì)胞和組織特異性抗原;可視化蛋白質(zhì)的存在與否、細(xì)胞定位和活化狀態(tài);并分析免疫反應(yīng)。CRT(Calreticulin)免疫組化IHC免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用,可以用于檢測(cè)病原體、肉瘤標(biāo)志物等。
細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢?步驟:1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上(較好可以放入24孔板),為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中,大約60-75%滿片即可,否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,現(xiàn)用現(xiàn)配。(以下各步驟切毋使玻片干燥)3. PBS沖洗;4. 0.1%Triton作用20分鐘;5. PBS沖洗;6. 10%正常血清封閉10分鐘;7. 加入一抗,4度孵育過夜(找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來,抗體就不容易溢出),還要記住“砸片”,就是抗體從較高處落到片子上,以分布均勻??贵w稀釋度1:60,較常用!8. PBS沖洗4次,各5分鐘;9加入熒光二抗,室溫30分鐘??贵w稀釋度1:400,較常用!10. 90%甘油封片。也很關(guān)鍵阿,多封幾次才有體會(huì)。12. 避光保存,或到顯微鏡下觀察。
免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1)熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,或于4℃保存4h,時(shí)間過長,會(huì)使熒光減弱。2)每次試驗(yàn)時(shí),需設(shè)置以下三種對(duì)照:①陽性對(duì)照:陽性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對(duì)照:陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對(duì)照:PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中,始終保持濕潤,避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物,應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色。熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。
免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟:細(xì)胞爬片免疫熒光:在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;(圓蓋片:13mm24孔;18mm12孔;20mm6孔)用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA(PBS配置),室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。CD36免疫熒光
使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見的操作步驟。CD36免疫熒光
熒光抗體技術(shù):抗原抗體反應(yīng)后,利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測(cè)方法。免疫熒光測(cè)定:抗原抗體反應(yīng)后,利用特殊儀器測(cè)定熒光強(qiáng)度而推算被測(cè)物濃度的檢測(cè)方法。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟:直接法測(cè)抗原:基本原理:將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高,非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低;而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。CD36免疫熒光