CK14免疫熒光IF

來源: 發(fā)布時間:2023-07-30

基于熒光成像的技術(shù)對于查詢細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用。當(dāng)與免疫化學(xué)結(jié)合時,熒光成像技術(shù)的分析能力增加,增強(qiáng)了這種技術(shù)在普遍的研究和臨床應(yīng)用中的實用性,使其成為寶貴的工具。免疫熒光顯微鏡通過使活細(xì)胞成像能夠可視化整個細(xì)胞器,徹底改變了細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進(jìn)行細(xì)胞分析的常用熒光成像技術(shù)。免疫熒光(IF)是一種強(qiáng)大的免疫染色技術(shù),利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標(biāo)分子結(jié)合的熒光素標(biāo)記抗體。免疫熒光用于鑒定細(xì)胞中的細(xì)胞和組織特異性抗原;可視化蛋白質(zhì)的存在與否、細(xì)胞定位和活化狀態(tài);并分析免疫反應(yīng)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。CK14免疫熒光IF

CK14免疫熒光IF,免疫

細(xì)胞的固定及免疫熒光:吸去一抗,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,37℃,室溫避光孵育1小時。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記,因此操作過程盡量在暗處進(jìn)行。吸去二抗,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。向玻片上滴加DAPI,或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核,一般為藍(lán)色熒光;避光孵育5-10min。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次,每次 5 min,洗去多余的DAPI。取爬片時由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,張力較大,可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上,然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,注意選擇抗體對應(yīng)的激發(fā)光源。C-FOS免疫免疫熒光技術(shù)中,以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù)。

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其他熒光物質(zhì):酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,后者可發(fā)出熒光,激發(fā)光波長為360nm,發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪(Eu3)、鋱(Tb3)、鈰(Ce3)等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,其中以Eu3應(yīng)用較廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,發(fā)射光波長范圍窄,熒光衰變時間長,較適合用于分辨熒光免疫測定。

免疫熒光的原理:免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時,只要知道其中的一個因素,就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體,直接加在抗原標(biāo)本上,經(jīng)一定的溫度和時間的染色,用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體,室溫下干燥后封片、鏡檢。免疫熒光技術(shù)可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號,從而確定目標(biāo)分子的存在和位置。

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免疫熒光實驗的注意事項:對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋度不應(yīng)超過1:20,抗體濃度過低,會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,影響結(jié)果的觀察。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,染色時間可以從10min到數(shù)小時,一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于37℃可加強(qiáng)染色效果,但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2℃的低溫,延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。Glut2免疫熒光IF

免疫熒光技術(shù)具有高靈敏度和高特異性,可以檢測非常低濃度的目標(biāo)分子。CK14免疫熒光IF

細(xì)胞免疫熒光實驗注意事項:非特異性染色:是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶;孵育過程中干片;抗原熱修復(fù)過度。染色過深:一抗?jié)舛冗^高;染色試濃度過高或孵育時間過長;染色劑濃度過高或孵育時間過長。通常實驗室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透,但若檢測抗原是水不溶性蛋白,可先通透再固定,這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號;建議設(shè)陰性對照組,消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色;選擇醛類固定液時,保持其新鮮度,較好現(xiàn)配現(xiàn)用,使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高。CK14免疫熒光IF

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