P62免疫檢測

來源: 發(fā)布時(shí)間:2023-07-21

熒光的產(chǎn)生:一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量(如光能、化學(xué)能等)而進(jìn)入激發(fā)態(tài),當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí),過剩的能量可以電磁輻射的形式放射(即發(fā)光)。熒光發(fā)射的特點(diǎn)是:可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光;而一旦停止供能,發(fā)光(熒光)現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。可以引起發(fā)熒光的能量種類很多,由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光,由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病。P62免疫檢測

P62免疫檢測,免疫

細(xì)胞的固定及免疫熒光:吸去一抗,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,37℃,室溫避光孵育1小時(shí)。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記,因此操作過程盡量在暗處進(jìn)行。吸去二抗,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。向玻片上滴加DAPI,或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核,一般為藍(lán)色熒光;避光孵育5-10min。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次,每次 5 min,洗去多余的DAPI。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,張力較大,可將注射器針頭針尖向背面做個(gè)小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上,然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,注意選擇抗體對應(yīng)的激發(fā)光源。VWF免疫熒光檢查免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活。

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細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段,則不需要通透;一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果;從加熒光二抗起,后面所有操作步驟盡量避光??s短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間,1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色:烤片溫度過高,推薦 56~60 ℃ 1~2 h;一抗是否適用固定液和石蠟切片,使用濃度是否過低,孵育是否時(shí)間過短等。

免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),因?yàn)闊晒馍夭坏芘c抗體球蛋白結(jié)合,用于檢測或定位各種抗原,也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合,用于檢測或定位抗體,但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù),或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用。

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細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中,需要用到細(xì)胞爬片,通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),細(xì)胞在爬片上生長,進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn):通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號放大;與直接免疫熒光相比,通過信號放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。CD14免疫組化

免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。P62免疫檢測

熒光色素:異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,F(xiàn)ITC)為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,較大吸收光波長為490495nm,較大發(fā)射光波長520530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,結(jié)構(gòu)式如下:有兩種同分異結(jié)構(gòu),其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,在冷暗干燥處可保存多年,是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是:①人眼對黃綠色較為敏感,②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明(rhodamine,RIB200)為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下:較大吸收光波長為570nm,較大發(fā)射光波長為595~600nm,呈橘紅色熒光。P62免疫檢測

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