AIRE-1免疫熒光

來源: 發(fā)布時(shí)間:2023-07-19

細(xì)胞的固定及免疫熒光:1)吸除培養(yǎng)基,一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次,每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,進(jìn)行細(xì)胞固定,室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,目的是使細(xì)胞通透。5) 除去Triton X-100,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(shí)(選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致)。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液,向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗(一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度,后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以摸索抗體的適宜濃度),4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。AIRE-1免疫熒光

AIRE-1免疫熒光,免疫

細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢?步驟:1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上(較好可以放入24孔板),為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中,大約60-75%滿片即可,否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,現(xiàn)用現(xiàn)配。(以下各步驟切毋使玻片干燥)3. PBS沖洗;4. 0.1%Triton作用20分鐘;5. PBS沖洗;6. 10%正常血清封閉10分鐘;7. 加入一抗,4度孵育過夜(找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來,抗體就不容易溢出),還要記住“砸片”,就是抗體從較高處落到片子上,以分布均勻??贵w稀釋度1:60,較常用!8. PBS沖洗4次,各5分鐘;9加入熒光二抗,室溫30分鐘??贵w稀釋度1:400,較常用!10. 90%甘油封片。也很關(guān)鍵阿,多封幾次才有體會。12. 避光保存,或到顯微鏡下觀察。HBCAg免疫熒光分析免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),用于檢測和定位特定抗原或抗體。

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免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng):為了保證熒光染色的正確性,初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對照,以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對照:標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。②特異性對照(抑制試驗(yàn)):標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽性對照:已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,陽性對照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,則為特異性陽性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min,就有熒光減弱現(xiàn)象,經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察,隨著時(shí)間的延長,熒光強(qiáng)度會逐漸下降。

免疫熒光注意事項(xiàng):對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置:1、內(nèi)源性組織背景對照:某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),會產(chǎn)生背景熒光,對結(jié)果產(chǎn)生影響,例如色素脂褐質(zhì)。因此在孵育一抗前,應(yīng)對樣品進(jìn)行觀察,確??乖旧頉]有信號。2、陽性對照:用確認(rèn)含有待測抗原的組織或細(xì)胞,與待測標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理,結(jié)果應(yīng)為陽性,可證明待測抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對照:與陽性對照相反,用明確不含有待測抗原的細(xì)胞或組織切片染色,結(jié)果若為陰性,可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果。免疫熒光技術(shù)可以用于研究內(nèi)臟移植和免疫抑制。

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免疫熒光間接法測抗體實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1)熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,或于4℃保存4h,時(shí)間過長,會使熒光減弱。2)每次試驗(yàn)時(shí),需設(shè)置以下三種對照:①陽性對照:陽性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對照:陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對照:PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中,始終保持濕潤,避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物,應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色。免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。SIRT7免疫

早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。AIRE-1免疫熒光

注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行.DAPI復(fù)染核:爬片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。封片:爬片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照:切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm,發(fā)射波長420nm,發(fā)藍(lán)光;FITC激發(fā)波長465-495nm,發(fā)射波長515-555nm,發(fā)綠光;CY3激發(fā)波長510-560,發(fā)射波長590nm,發(fā)紅光)。兩種抗體同時(shí)孵育:由于FIT容易萃滅,因此在孵育抗體時(shí)后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。AIRE-1免疫熒光

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