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免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟:細(xì)胞爬片免疫熒光:在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;(圓蓋片:13mm24孔;18mm12孔;20mm6孔)用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA(PBS配置),室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。免疫熒光技術(shù)可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號(hào),從而確定目標(biāo)分子的存在和位置。MMP13免疫熒光試驗(yàn)
其他熒光物質(zhì):酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,后者可發(fā)出熒光,激發(fā)光波長為360nm,發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪(Eu3)、鋱(Tb3)、鈰(Ce3)等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,其中以Eu3應(yīng)用較廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,發(fā)射光波長范圍窄,熒光衰變時(shí)間長,較適合用于分辨熒光免疫測定。MMP13免疫熒光試驗(yàn)免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達(dá)調(diào)控。
免疫熒光通過抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng),進(jìn)而對抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出,熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光,可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,利用定量技術(shù)測定含量,從而可對抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析。細(xì)胞免疫熒光用途:快速直觀顯示所檢測蛋白的細(xì)胞定位。材料與儀器:樣品:貼壁細(xì)胞;試劑:4% 組織固定液,PBS,Triton X-100,BSA,熒光二抗,免疫熒光染色二抗稀釋液,抗熒光猝滅封片液,0.25% 胰酶;器材:6/12/24 孔板,細(xì)胞爬片(蓋玻片),載玻片,15 ml 離心管。
免疫熒光間接法:如檢查未知抗原,先用已知未標(biāo)記的特異抗體(一抗體)與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng),用水洗去未反應(yīng)的抗體,再用標(biāo)記的抗抗體(第二抗體)與抗原標(biāo)本反應(yīng),使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物,再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體,干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體,則表明抗原標(biāo)本是已知的,待檢血清為一抗體,其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體,同于血清球蛋白有種的特異性,如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng),因此,制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。免疫熒光技術(shù)可以同時(shí)檢測多個(gè)目標(biāo)分子,通過不同顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。
細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見問題:1、信號(hào)弱或者無信號(hào):細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過長;2)抗體濃度不合適,參照抗體說明書的稀釋濃度,再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索;3)一抗孵育時(shí)間不合適,建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景:封閉不充分;抗體濃度過高;抗體孵育時(shí)間過長或溫度過高;清洗不充分;樣本變干,染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多:固定液殘留,這里需要縮短固定時(shí)間并且在封閉液中加甘氨酸,并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色;二抗殘留,二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大,那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。在1941年,Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。JNK免疫熒光染色
免疫熒光技術(shù)可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治。MMP13免疫熒光試驗(yàn)
免疫熒光間接法測抗體實(shí)驗(yàn)步驟:滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片,10min后棄去,使標(biāo)本片保持一定濕度。滴加以0.01mol/L,pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫30min。取出玻片,置于玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗1-2次,然后按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸5min,不時(shí)振蕩。取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標(biāo)本干燥,滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫30min。重復(fù)操作3。取出玻片,用濾紙吸去多余水分,滴加一滴緩沖甘油,再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察,結(jié)果判定同直接法。MMP13免疫熒光試驗(yàn)
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