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細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢?步驟:1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上(較好可以放入24孔板),為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中,大約60-75%滿片即可,否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,現(xiàn)用現(xiàn)配。(以下各步驟切毋使玻片干燥)3. PBS沖洗;4. 0.1%Triton作用20分鐘;5. PBS沖洗;6. 10%正常血清封閉10分鐘;7. 加入一抗,4度孵育過夜(找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來,抗體就不容易溢出),還要記住“砸片”,就是抗體從較高處落到片子上,以分布均勻??贵w稀釋度1:60,較常用!8. PBS沖洗4次,各5分鐘;9加入熒光二抗,室溫30分鐘。抗體稀釋度1:400,較常用!10. 90%甘油封片。也很關(guān)鍵阿,多封幾次才有體會(huì)。12. 避光保存,或到顯微鏡下觀察。免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),用于檢測(cè)和定位特定抗原或抗體。CD42b免疫
檢測(cè)復(fù)雜的生物學(xué)結(jié)構(gòu)需要較高清晰度的熒光信號(hào),并將熒光信號(hào)從背景噪聲中分離開來。標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光標(biāo)記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于:需要精細(xì)調(diào)整樣品信號(hào)達(dá)到峰值特異性、高清晰度和較佳放大倍數(shù)。雖然熒光基團(tuán)是進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞成像的較佳選擇,但不可避免地也極易發(fā)生光漂白,即熒光信號(hào)的光化學(xué)降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差,產(chǎn)生假性結(jié)果??勾銣绶馄瑒┛梢员Wo(hù)熒光標(biāo)記蛋白的穩(wěn)定性,維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的圖像信號(hào)完整度。BMP2免疫熒光染色免疫熒光技術(shù)中,以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù)。
免疫熒光間接法:如檢查未知抗原,先用已知未標(biāo)記的特異抗體(一抗體)與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng),用水洗去未反應(yīng)的抗體,再用標(biāo)記的抗抗體(第二抗體)與抗原標(biāo)本反應(yīng),使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物,再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體,干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體,則表明抗原標(biāo)本是已知的,待檢血清為一抗體,其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體,同于血清球蛋白有種的特異性,如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng),因此,制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。
免疫熒光的原理和類型:免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長(zhǎng)(分子的吸收光譜)下吸收光子的特性,經(jīng)過短暫的間隔(發(fā)射光譜)后以較高的波長(zhǎng)發(fā)射光子,并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到。熒光團(tuán)可以通過可見光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場(chǎng)上購買,其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長(zhǎng)范圍。它們不會(huì)損傷活細(xì)胞,可安全用于生物制劑。在進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)時(shí),首先對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理。進(jìn)行免疫染色時(shí),熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合,然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號(hào)。根據(jù)使用的抗體和所需的信號(hào)擴(kuò)增,免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù)。
免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟:細(xì)胞爬片免疫熒光:在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;(圓蓋片:13mm24孔;18mm12孔;20mm6孔)用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA(PBS配置),室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用。BMP2免疫熒光染色
免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用,可以用于檢測(cè)病原體、肉瘤標(biāo)志物等。CD42b免疫
熒光物質(zhì),熒光色素:許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有:⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,較大吸收光波長(zhǎng)為490--495nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)520--530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,結(jié)構(gòu)式如下:有兩種同分異結(jié)構(gòu),其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,在冷暗干燥處可保存多年,是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是:①人眼對(duì)黃綠色較為敏感,②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下:較大吸收光波長(zhǎng)為570nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)為595~600nm,呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下:較大吸引光波長(zhǎng)為550nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧F洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合,但熒光效率較低。CD42b免疫
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