外泌體機(jī)制研究套路

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2023-03-08

透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)是用于評(píng)估外泌體形態(tài)、大小和表型的的兩種常見(jiàn)的電子顯微鏡。SEM和TEM均使用電子束產(chǎn)生高分辨率的亞微米顆粒放大圖像,以區(qū)分外泌體與殘留在樣品中相似大小的非外泌體顆粒,該方法還可用于檢查樣品的純度。TEM與SEM之間的區(qū)別在于檢測(cè)電子類別,在SEM中,電子與樣品中的粒子相互作用時(shí)會(huì)發(fā)生散射,捕獲并檢測(cè)散射的電子,從而生成粒子圖像。但是,在TEM中,不與粒子相互作用的電子穿過(guò)樣品,并使用熒光屏進(jìn)行檢測(cè)。電子顯微鏡下外泌體大小不一,通常呈茶托樣的圓形或橢圓形。采用電子顯微鏡檢測(cè)外泌體時(shí)對(duì)樣品的預(yù)處理和制備要求較高,外泌體的提取方法和品質(zhì)會(huì)對(duì)電鏡結(jié)果造成影響;另外樣品的準(zhǔn)備階段比較復(fù)雜,不適合進(jìn)行大量快速的測(cè)量;而且由于樣本經(jīng)過(guò)了干燥、固定以及冷凍等預(yù)處理和制備過(guò)程,對(duì)生物樣本的結(jié)構(gòu)會(huì)造成一定的破壞,從而影響觀察的效果,無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量外泌體濃度。外泌體產(chǎn)生相關(guān)的重要分子:Ral、ARF6、PLD2、RAB家族。外泌體機(jī)制研究套路

外泌體機(jī)制研究套路,外泌體提取試劑盒

流式細(xì)胞技術(shù)是細(xì)胞和小顆粒定性和定量表征的有效方法,其用于外泌體定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性也在不斷上升。將外泌體表面特異性標(biāo)志物CD63、CD81等相應(yīng)抗體進(jìn)行標(biāo)記,可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到陽(yáng)性表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體的定量。但流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)時(shí)需要單顆粒懸浮液,當(dāng)外泌體濃度高或分離過(guò)程中發(fā)生外泌體囊泡聚集時(shí)將導(dǎo)致一次觀察到多個(gè)顆粒,從而導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。因此,為了通過(guò)流式細(xì)胞儀觀察,需要將外泌體通過(guò)免疫捕獲或共價(jià)結(jié)合固定在磁珠表面上,從而便于將外泌體囊泡暴露于已知或者預(yù)期在外泌體表面表達(dá)的抗原的熒光偶聯(lián)抗體中。在流式細(xì)胞術(shù)之前,可在落射熒光顯微鏡(EPI)下觀察與磁珠和熒光抗體偶聯(lián)的外泌體囊泡。當(dāng)樣品通過(guò)流式細(xì)胞儀時(shí)采集熒光信號(hào),不只可以對(duì)外泌體進(jìn)行高通量分析,還可以基于抗原表達(dá)對(duì)外泌體進(jìn)行定量或分類。乳液提取試劑盒方法外泌體是具有生物活性的脂雙層囊泡。

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細(xì)胞外囊泡是蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和脂質(zhì)運(yùn)輸來(lái)完成細(xì)胞間通訊通路的重要媒介,根據(jù)它們的大小和發(fā)生分為三類,包括外泌體、微泡和凋亡小體。其中,外泌體是直徑大約為40-100nm的包裝囊泡,由多種細(xì)胞分泌,內(nèi)含有特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞因子或遺傳物質(zhì)。來(lái)源于不同的組織的外泌體不只具有其特異性蛋白分子,而且還包含其行使功能的關(guān)鍵分子。近年來(lái),隨著外泌體研究的不斷深入,它的應(yīng)用已經(jīng)涉及瘤子診療領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和免疫領(lǐng)域、寄生蟲(chóng)領(lǐng)域;臨床研究上已涉及心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)等。

為什么超速離心提取外泌體看不到沉淀?答:這種問(wèn)題通常有三種可能性,其一:使用的細(xì)胞上清或者血清量太低,從而造成了這樣的結(jié)果。其二:使用了不透明的超速離心管,一般來(lái)說(shuō)外泌體產(chǎn)量都比較小,所以凡是不透明的管子,基本都是比較難見(jiàn)到明顯沉淀的,可以當(dāng)做有沉淀,然后操作下去即可。其三:使用了角轉(zhuǎn)。部分品牌離心機(jī)的角轉(zhuǎn)管壁粘附性比較低,超離結(jié)束沒(méi)多久沉淀就會(huì)滑落下去,所以請(qǐng)?jiān)陔x心結(jié)束時(shí)趕緊去收樣。外泌體的角色:1、外泌體發(fā)揮功能并一定需要受體細(xì)胞攝入外泌體:外泌體的膜蛋白有可能與細(xì)胞膜蛋白作用,活躍細(xì)胞內(nèi)通路。2、外泌體的角色之一:細(xì)胞-細(xì)胞通訊,比如抗原遞呈。外泌體屬于胞外囊泡類,除了外泌體之外細(xì)胞還分泌微泡以及其它的膜囊泡。

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外泌體遞送藥物的優(yōu)勢(shì):許多新的候選藥物(例如蛋白質(zhì)和核酸)在體內(nèi)環(huán)境中高度不穩(wěn)定,對(duì)診療結(jié)果的效果提出了重大挑戰(zhàn)。鑒于與許多當(dāng)前的納米微粒遞送系統(tǒng)相關(guān)的問(wèn)題,外泌體作為“自然的遞送系統(tǒng)”允許遞送這些生物分子。由于外泌體體積小和其本身就是細(xì)胞產(chǎn)物,通過(guò)外泌體遞送藥物可以避免巨噬細(xì)胞的吞噬作用或降解,還可以在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間循環(huán),保持效果。其中,外泌體能夠穿過(guò)血腦屏障以將特定藥物輸送到中樞的神經(jīng)系統(tǒng)是外泌體遞送藥物的一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)。外泌體膜中有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2。外泌體作為蛋白質(zhì)的藥物遞送載體。海洋生物外泌體tmt

外泌體膜蛋白可以被蛋白酶剪切,剪切的碎片可以作為配體與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,從而活躍細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路。外泌體機(jī)制研究套路

外泌體中常見(jiàn)的細(xì)胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白,是鳥(niǎo)苷酸三磷酸酶家族的一種。它可以調(diào)節(jié)外泌體膜與受體細(xì)胞的融合,有文獻(xiàn)報(bào)道稱RAB4,RAB5和RAB11主要出現(xiàn)在早期以及回收的核內(nèi)體中,RAB7和RAB9主要出現(xiàn)在晚期的核內(nèi)體?,F(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白。除了RAB蛋白,外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白(包括膜聯(lián)蛋白1、2、4、5、6、7、11等)。外泌體膜上富含參與外泌體運(yùn)輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹–D63,CD81和CD9))、熱休克蛋白家族((HSP60,HSP70,HSPA5,CCT2和HSP90以及一些細(xì)胞特異性的蛋白包括A33(結(jié)腸上皮細(xì)胞來(lái)源)、MHC-Ⅱ(抗原提呈細(xì)胞來(lái)源)、CD86(抗原提呈細(xì)胞來(lái)源)以及乳凝集素(不成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞)。外泌體發(fā)揮功能:將細(xì)胞或組織中多余的或者有害的分子排除,這為研究生物標(biāo)志物提供了可能。外泌體機(jī)制研究套路

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