江西樣本pcr實(shí)驗(yàn)

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的3’RACE-PCR介紹：利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)1號鏈cDNA.然后用一個(gè)基因特異引物GSP1(genespecificprimer,GSP)作為上游引物，用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM(universalprimer,UPM)作為下游引物，以cDNA1號鏈為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因3‘末端的。DNA的片段擴(kuò)增出來。

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原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項(xiàng)有較大潛力的新技術(shù)。原位PCR是Hasse等于1990年建立的，實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等。其基本方法為：1、固定組織或細(xì)胞:將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶。2、蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細(xì)胞片55℃消化處理2h后，96℃2min以滅活蛋白酶K。3、PCR擴(kuò)增:在組織細(xì)胞片上，加PCR反應(yīng)液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上，進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增。有的基因擴(kuò)增儀帶有專門用于原位PCR的裝置。4、雜交:PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交。5、顯微鏡觀察結(jié)果。遼寧細(xì)胞pcr怎么選擇pcr檢測知識要點(diǎn)總結(jié)匯總。

PCR反應(yīng)的比較大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭疼的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。主要原因有：1、標(biāo)本間交叉污染；2、PCR試劑的污染；3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染；4、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染。一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。1、陽性對照：在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。2、陰性對照：每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對照。它包括：（1）標(biāo)本對照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。（2）試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測試劑是否污染。3、重復(fù)性試驗(yàn)。4、選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

pcr防止污染的方法(一)合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行。(二)吸樣器:吸樣器污染是一個(gè)值得注意的問題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入器內(nèi)或粘上器頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心。(三)預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。(五)設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的比較低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照。(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止。(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。pcr檢測實(shí)驗(yàn)有哪些分類？

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的兼并引物PCR（DegeneratePrimer）介紹：兼并引物是指代替編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，產(chǎn)物特異性越強(qiáng)。設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)盡量選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，因?yàn)?'端末尾3個(gè)堿基的退火足以在錯(cuò)誤位點(diǎn)起始PCR；次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。因此，在引物設(shè)計(jì)時(shí),比較選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3'端被兼并，因?yàn)?'端末尾3個(gè)堿基的退火足以在錯(cuò)誤位點(diǎn)起始PCR;次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。實(shí)驗(yàn)證明，用脫氧肌苷引物進(jìn)行PCR,可以代替編碼蛋白的多種兼并密碼子中的兼并堿基。英瀚斯生物，確保pcr檢測結(jié)果真實(shí)性。遼寧熒光定量pcr

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PCR的假陽性主要原因之一引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)器頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。江西樣本pcr實(shí)驗(yàn)

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