免疫組化如何才能充分脫蠟?
(1)蠟不溶于水,如果脫蠟不干凈,少許蠟存留于切片上,將會(huì)引起染色不均勻、陽(yáng)性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問(wèn)題,切片在染色前必須徹底脫蠟,目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯,因它脫蠟力強(qiáng),脫蠟時(shí)間較短;
(2)脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季節(jié),室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天,室溫較高,脫蠟試劑也新鮮,則脫蠟時(shí)間不需很多,3-5分鐘就已足夠。如果在冬天,室溫較低,脫蠟試劑也較陳舊,則脫蠟時(shí)間需要延長(zhǎng),10-20分鐘或更長(zhǎng)。
(3)當(dāng)天切的切片,燒烤2小時(shí)后進(jìn)行染色,切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過(guò)程,如果預(yù)先切好烤好的切片,在染色前,還必須對(duì)切片進(jìn)行加溫10-20分鐘,然后再行脫蠟,這樣脫蠟速度加快,效果魁偉更好。總之,操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié),不同的室溫,不同的試劑來(lái)決定,脫蠟的時(shí)間,原則上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟。
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免疫組化的特點(diǎn):
1)特異性強(qiáng)。免疫學(xué)的基本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性,因此,免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示,如角蛋白(keratin)顯示上皮成分,LCA顯示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí),才會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。
2)敏感性高。在應(yīng)用免疫組化的起始階段,由于技術(shù)上的限制,只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù),那時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍;現(xiàn)在由于ABC法或SP三步法的出現(xiàn),使抗體稀釋上千倍、上萬(wàn)倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合,這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng),使免疫組化方法越來(lái)越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。
3)定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合。該技術(shù)通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng),可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位,因而可同時(shí)對(duì)不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察,這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究,對(duì)病理學(xué)領(lǐng)域開(kāi)展深入研究是十分有意義的。
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免疫組化指的是根據(jù)抗體與抗原特異結(jié)合的原理來(lái)檢測(cè)組織切片中的抗原(如蛋白)。immuno的詞根來(lái)自操作中所使用的抗體,而histo意味著組織。另一種類似的技術(shù)是免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry,簡(jiǎn)稱ICC)。這兩個(gè)詞大家經(jīng)?;熘?,看著好像差不多,但實(shí)際上還是有點(diǎn)區(qū)別。IHCvsICC對(duì)于IHC,組織是來(lái)自患者或動(dòng)物,經(jīng)過(guò)冷凍或石蠟包埋。將這些組織制成約4μm厚的切片,封片后再處理。通過(guò)這種方法,研究人員可觀察細(xì)胞組分的定位,同時(shí)維持周?chē)M織的原先結(jié)構(gòu)。對(duì)于ICC,大部分細(xì)胞外基質(zhì)及其他基質(zhì)組分被去除,只剩下整個(gè)細(xì)胞來(lái)染色。ICC的來(lái)源可以是細(xì)胞懸液,來(lái)自患者或動(dòng)物(如血涂片、拭子等),或在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的組織培養(yǎng)細(xì)胞系。
做免疫組化時(shí)如何選擇一抗?
1、單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合,就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面,即使是同一個(gè)抗原決定簇,在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆來(lái)產(chǎn)生抗體,形成好幾種單克隆抗體混雜物,稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中,一般單克隆抗體特異性強(qiáng),但親和力相對(duì)小,檢測(cè)抗原靈敏度相對(duì)就低;而多克隆抗體特異性稍弱,但抗體的親和力強(qiáng),靈敏度高,但易出現(xiàn)非特異性染色(可以通過(guò)封閉等避免)。
2、應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于Westernblotting,或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等;甚至標(biāo)明石蠟切片或冰凍切片。
3、種屬反應(yīng)性的選擇(speciesreactivity)。這一點(diǎn)很重要,表明這種抗體可能存在種屬差別,且這種抗體適合檢測(cè)哪種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。
4、種屬來(lái)源,一般兔來(lái)源的多是多克隆抗體;而小鼠來(lái)源的多是單克隆抗體,但也有另外。根據(jù)此來(lái)源來(lái)選擇相應(yīng)的二抗。
5、生產(chǎn)廠家的選擇。
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免疫組化的結(jié)果分析:
免疫組化實(shí)驗(yàn)通常需要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照(或替代對(duì)照)(陽(yáng)性對(duì)照是排除方法和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有無(wú)問(wèn)題;陰性對(duì)照與替代對(duì)照是排除有無(wú)非特異性染色)。一般情況下,陽(yáng)性對(duì)照顏色的特點(diǎn)為:Ag定位,包漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結(jié)構(gòu)性。且染色的強(qiáng)度不同(顏色深淺不一);陰性對(duì)照的特點(diǎn)為:染色細(xì)胞與組織無(wú)區(qū)別,顏色具有彌散性,分布均勻。
英瀚斯生物可承接各類病理染色,包括免疫組化。
說(shuō)明:免疫組化實(shí)驗(yàn)可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析,但要實(shí)驗(yàn)得到的必須是高質(zhì)量的染色切片,要求背景染色淺且特異性染色較深,這樣分析的結(jié)果才會(huì)比較準(zhǔn)確。 江蘇細(xì)胞免疫組化要多少錢(qián)
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