磷酸鈉緩沖液(0.5mol/L

殺滅曲線的建立：通過建立殺滅曲線（劑量反應曲線），確定能夠殺死未轉染宿主細胞的較低濃度，從而篩選得到穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株。建立殺滅曲線至少選擇5個濃度。1、按照20-25%的細胞密度將未轉化的細胞鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2過夜培養(yǎng)（需要更高密度，可增加接種量）。2、根據(jù)細胞類型，設定合適的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例，可設定50，100，250，500，750，1000μg/mL。3、第2天換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養(yǎng)基，每個濃度做三個平行孔。4、接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。5、按照每2天進行活細胞計數(shù)，來確定殺滅未轉染細胞的恰當濃度。通常7-10天內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細胞的較低濃度為篩選用的工作濃度。科研實驗中試劑取用應注意事項：應在容器的正上方垂直滴入；膠頭滴管不要接觸容器壁。磷酸鈉緩沖液(0.5mol/L,pH6.8)

穩(wěn)定轉染細胞的篩選：1、轉染48 h后，用含適當濃度的潮霉素B篩選培養(yǎng)基來傳代細胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。注意：細胞處于活躍分裂狀態(tài)時的殺傷效果較好。但細胞過于稠密，其效率會降低，較好將細胞稀釋至豐度低于25%。2、每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。3、篩選7天后觀察并評估細胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間（取決于宿主細胞類型，轉染，以及篩選效果）。4、挑取并轉移5-10個抗性克隆于35mm細胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。5、后續(xù)更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。磷酸鈉緩沖液(0.5mol/L,pH6.8)固體試劑的取用:取固體量較多時用大匙,較少時用小匙。

加藥時間:由于基因轉染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒，終導致篩選不出陽性克隆，一般要在轉染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降至200ug/ml。培養(yǎng)液:加藥篩選約6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞。這時會出現(xiàn)兩個問題：1.死亡的細胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導致那些有neo表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡。2.孔中細胞數(shù)目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉染3T3細胞，在3T3細胞匯合度達到80%的時候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉染后篩選過程中就可以應用這種培養(yǎng)基。

Tricine加樣緩沖液(2×)使用說明書 說明書：①試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。②實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。③使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。④加入試劑的順序，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。⑤按說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。Tricine加樣緩沖液(2×)：產(chǎn)品規(guī)格：5ml。分類：電泳蛋白。儲存條件：—20℃,12個月。用途：又稱三羥甲基甘氨酸加樣緩沖液,Tris-tricine緩沖系統(tǒng)的PAGE電泳。注意事項：主要由Tris-HCl、DTT、G-250等組成。DC細胞誘導：胞形態(tài)，至細胞毛刺樣突起，有典型DC形態(tài)懸浮細胞。

主要試劑配制：（1）PBS：PBS粉劑每袋加ddH2O定容至1000mL，調(diào)pH7.2，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?。?）RPIM-1640培養(yǎng)基：臨用前根據(jù)需要加15%胎牛血清，較后按1%體積分數(shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 U/mL，置于4℃冰箱保存。（3）臺盼藍染液：稱取4g臺盼藍，于研缽中用少量雙蒸水研磨，加雙蒸水至100mL，1500rpm離心15min，吸取上層液，即為4%水溶液。用前，用1.8%氯化鈉溶液稀釋1倍，即為2%臺盼藍染液。丁胺卡那霉素給藥說明：配制靜脈用藥時，每500mg加入氯化鈉注射液。磷酸鈉緩沖液(0.5mol/L,pH6.8)

利福平溶液怎么配制：過濾滅菌后，小份分裝（1-2ml每管）后，置于－20℃保存。磷酸鈉緩沖液(0.5mol/L,pH6.8)

hochest染色和DAPI染色有什么區(qū)別：1、每個染料有自己獨特的激發(fā)譜線和發(fā)射譜線.這也是以上兩個染料的主要區(qū)別. 另外Hoechest 33258 是膜透性的,因此在活細胞時候能輕松進入;DAPI是半透性的,有選擇性的進入.因此Hoechest 33258 一般用來染活細胞,可以長驅(qū)直入;DAPI一般是染固定細胞.2、兩者都可以用紫外看，參見以下的激發(fā)發(fā)射波長Hoechst 33258的較大激發(fā)波長為346nm，較大發(fā)射波長為460nm；Hoechst 33258和雙鏈DNA結合后，較大激發(fā)波長為352nm，較大發(fā)射波長為461nm。DAPI的較大激發(fā)波長為340nm，較大發(fā)射波長為488nm；DAPI和雙鏈DNA結合后，較大激發(fā)波長為364nm，較大發(fā)射波長為454nm。磷酸鈉緩沖液(0.5mol/L,pH6.8)