南京組織RT-PCR檢測技術服務

聚合酶鏈式反應：三步：變性：模板DNA加熱變性；復性，引物與它的靶序列發(fā)生退火，引物DNA量多，使引物和模板在局部形成雜交鏈；延伸，4種dNTP 與 Mg2+ 存在的條件下，DNA合成酶催化以引物為起始點，按5'-3'方向進行延伸。上面三步為一個循環(huán)，可使拷貝數(shù)到達2*E－6-2*E－7。PCR產(chǎn)物一段雙鏈DNA，是由它的末端引物的5’端決定的。首輪擴增，其產(chǎn)物是大小不均一的DNA分子。長度應大于兩引物之間的長度。在第二個循環(huán)中，由于5'固定，其產(chǎn)物長度就由等于兩引物之間的長度。所以幾十個循環(huán)后就會產(chǎn)生大量的兩引物之間序列。聚合酶鏈式反應準備：引物內(nèi)部不應出現(xiàn)互補序列。南京組織RT-PCR檢測技術服務

聚合酶鏈式反應：DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發(fā)展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。上海血液熒光定量PCR聚合酶鏈反應可以選擇這些突變來理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的，并改變或改善蛋白質(zhì)功能。

聚合酶鏈式反應的常見問題：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

聚合酶鏈反應的一個主要限制是，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴增的引物，需要關于目標序列的先前信息。這意味著，通常情況下，PCR用戶必須知道兩個單鏈模板中每個模板上目標區(qū)域上游的精確序列，以確保DNA聚合酶正確結合引物-模板雜交體，并隨后在DNA合成過程中產(chǎn)生整個目標區(qū)域。像所有酶一樣，DNA聚合酶也容易出錯，這反過來會導致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變。PCR的另一個限制是，即使是很少量的污染DNA也可以被擴增，導致誤導或模糊的結果。為了很大限度地減少污染的可能性，調(diào)查人員應該為試劑制備、聚合酶鏈反應和產(chǎn)品分析預留單獨的房間。試劑應分配到一次性的等分試樣中。應經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應得到解決。

聚合酶鏈式反應：Taq(水生棲熱菌)聚合酶耐熱DNA聚合酶的很好活性溫度約為75-80°C(167-176°F),盡管該酶通常使用72°C(162°F)的溫度。在該步驟中，DNA聚合酶通過從反應混合物中添加在5’-至-3’方向上與模板互補的游離DNA鏈來合成與DNA模板鏈互補的新DNA鏈，在新生(伸長)DNA鏈的末端，將dNTPs的5'-磷酸基與3'-羥基縮合。延伸所需的精確時間取決于所使用的DNA聚合酶和要擴增的DNA目標區(qū)域的長度。根據(jù)經(jīng)驗，在很好溫度下，大多數(shù)DNA聚合酶每分鐘聚合一千個堿基。在很好條件下(即，如果沒有限制底物或試劑的限制)，在每個延伸/延伸步驟中，DNA靶序列的數(shù)量加倍。隨著每一個連續(xù)的循環(huán)，原始模板鏈加上所有新產(chǎn)生的鏈成為下一輪延伸的模板鏈，導致特定DNA目標區(qū)域的指數(shù)(幾何)擴增。熱啟動/冷完成聚合酶鏈反應是通過新的雜合聚合酶實現(xiàn)的，這些酶在環(huán)境溫度下不活躍。南京組織RT-PCR檢測技術服務

嵌套聚合酶鏈反應：通過減少DNA非特異性擴增的背景，提高DNA擴增的特異性。南京組織RT-PCR檢測技術服務

聚合酶鏈式反應的特點：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=-6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位）；在細菌學中很小檢出率為3個細菌。簡便、快速：PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。南京組織RT-PCR檢測技術服務