淮南冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)方案

冷凍電鏡技術(shù)基本原理之電鏡三維重構(gòu)理論：D.DeRosier和A.Klug提出三維重構(gòu)理論是借助一系列沿不同方向投影的電子顯微像來重構(gòu)被測物體的立體構(gòu)型，利用計算機數(shù)字圖像處理技術(shù)進(jìn)行電子顯微像三維重構(gòu)測定生物大分子結(jié)構(gòu)的概念和方法。透射電子顯微鏡成像過程中，電子束穿透樣品，將樣品的三維電勢密度分布函數(shù)沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上。運用中心截面定理，從而可以通過三維物體不同角度的二維投影在計算機內(nèi)進(jìn)行三維重構(gòu)來解析獲得物體的三維結(jié)構(gòu)。主要使用的幾種冷凍電子顯微學(xué)技術(shù)結(jié)構(gòu)解析方法包括：電子晶體學(xué)、單顆粒重構(gòu)技術(shù)、電子斷層掃描等。淮南冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)方案

什么是冷凍電鏡技術(shù)？冷凍電鏡技術(shù)，全稱是冷凍電子顯微鏡技術(shù)，是在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術(shù)。冷凍電鏡技術(shù)，是一種重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方法，它與X射線晶體學(xué)、核磁共振一起構(gòu)成了高分辨率結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。冷凍電鏡技術(shù)的研究，主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術(shù)。根據(jù)諾貝爾獎評委會的說法，冷凍電鏡技術(shù)使生物分子成像，變得更加簡單，把生物化學(xué)帶入了一個新紀(jì)元。這項技術(shù)可以用來確定，溶液中生物分子的高清晰度結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)其實比較抽象，一直以來它主要的問題是其圖像噪音極高、信號極低，研究的目標(biāo)是從中提取近原子分辨率的結(jié)構(gòu)信息。可以形象的比喻為在一個機器轟鳴的工廠，監(jiān)測一只螞蟻爬行的聲音。冷凍電鏡的目標(biāo)，就是要完成這項艱巨的任務(wù)。因此，可見這項技術(shù)成果的科學(xué)價值。宜昌快速冷凍顯微鏡技術(shù)特點冷凍電鏡技術(shù)的研究，主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術(shù)。

冷凍電鏡技術(shù)原理之電子斷層掃描成像技術(shù)：通過在顯微鏡內(nèi)傾轉(zhuǎn)樣品從而收集樣品多角度的電子顯微圖像并對這些電子顯微圖像根據(jù)傾轉(zhuǎn)幾何關(guān)系進(jìn)行重構(gòu)的方法稱為電子斷層掃描成像技術(shù)。該方法主要應(yīng)用于細(xì)胞及亞細(xì)胞器，以及沒有固定結(jié)構(gòu)的生物大分子復(fù)合物(分子量范圍為800kD)，Zgao分辨率約2nm。冷凍電鏡的分類：目前我們討論的冷凍電鏡基本上指的都是冷凍透射電鏡，但是如果我們以使用冷凍技術(shù)的角度定義冷凍電鏡的話，冷凍電鏡主要可以分為冷凍透射電鏡、冷凍掃描電鏡、冷凍蝕刻電子顯微鏡。

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的圖像處理技術(shù)：經(jīng)過多年的發(fā)展，目前冷凍電鏡的數(shù)據(jù)處理部分主要包含了以下的流程：(1)襯度傳遞函數(shù)的修正(CTFcorrection)；(2)樣品分子投影數(shù)據(jù)的篩選(particleselection)；(3)二維投影數(shù)據(jù)的分類和降噪(2Danalysis)；(4)三維模型的重構(gòu)和優(yōu)化(3Dreconstructionandrefinement)；(5)多重構(gòu)象的結(jié)構(gòu)分析(heterogeneityanalysis)；(6)對重建結(jié)構(gòu)分辨率的分析(structureresolutionassessment)；(7)結(jié)合生物化學(xué)原理和實驗數(shù)據(jù)對三維結(jié)構(gòu)的解讀(modelinterpretationandvalidation)。冷凍電鏡技術(shù)之冷凍透射電鏡通常是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設(shè)備。

低溫透射電鏡技術(shù)的應(yīng)用：膠束體系對于濃度、pH、添加劑種類等液相環(huán)境條件的變化非常敏感，如果是干燥狀態(tài)其結(jié)構(gòu)與有液相完全不同，因此必須用低溫透射電鏡表征其結(jié)構(gòu)。通常情況下，膠束有球狀、囊泡狀、棒狀、層狀、六角束狀、洋蔥狀、蠕蟲狀等多種形狀，應(yīng)用低溫透射電鏡技術(shù)，囊泡、膠束的結(jié)構(gòu)可以被原位的真實呈現(xiàn)出來，可清晰地觀察到囊泡的完整性、分布、大小、融合等情況，而在普通電鏡條件下，干燥后的囊泡的形狀、結(jié)構(gòu)很容易發(fā)生變化。同樣，低溫透射電鏡也能夠有效保持聚合物在液相的形態(tài)，可清晰地觀察到聚合物的形態(tài)及聚集狀態(tài)。目前，低溫透射電鏡在生物大分子的成像尤其是蛋白結(jié)構(gòu)的解析方面已經(jīng)取得了諸多突破的成果，相信在化學(xué)分子材料領(lǐng)域也會展現(xiàn)很好的應(yīng)用前景。冷凍電鏡技術(shù)助力快速、高效的新藥研發(fā)。南京冷凍電子顯微鏡技術(shù)特點

冷凍電鏡技術(shù)可以通過揭示細(xì)胞里發(fā)生的生命過程細(xì)節(jié)，幫助人們了解很多有意思的生物學(xué)現(xiàn)象。淮南冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)方案

冷凍電鏡技術(shù)工作流程：首先是樣品制備。高純度、高濃度的蛋白樣品溶液被滴在一個特制的樣品載網(wǎng)上面。載網(wǎng)由一張布滿小孔的超薄非晶碳薄膜和金屬支撐框架組成，在表面張力的作用下，微孔上會形成一層跨孔的薄水膜。將多余溶液吸走后，把載有蛋白溶液超薄膜的載網(wǎng)迅速投入到液態(tài)乙烷冷凍劑中使其快速冷凍，從而使蛋白質(zhì)分散固定在玻璃態(tài)的冰膜中。然后電鏡圖像采集。選擇較有可能產(chǎn)生較佳圖像的較佳顆粒密度和玻璃態(tài)冰厚度的樣品。淮南冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)方案