珠海實(shí)時(shí)Real-time PCR原理及步驟

Real-time PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)較敏感、較準(zhǔn)確的方法。如果用于RNA檢測(cè)，這被稱為逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR即（Real-timeRT-PCR）是實(shí)時(shí)PCR法，它是指對(duì)DNA或經(jīng)過反轉(zhuǎn)入（RT-PCR）的RNA通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA的放大過程，在擴(kuò)增的指數(shù)增長(zhǎng)期就測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物，因?yàn)閿U(kuò)增指數(shù)增長(zhǎng)期測(cè)量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關(guān)性，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。Real-time PCR的基本目標(biāo)是精確測(cè)量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監(jiān)測(cè)CT值而實(shí)現(xiàn)對(duì)原始目標(biāo)基因的含量定量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法較大的優(yōu)點(diǎn)是克服了終點(diǎn)PCR法進(jìn)入平臺(tái)期或叫飽和期后定量的較大誤差，實(shí)現(xiàn)DNA/RNA的精確定量。該技術(shù)不單單實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無污染、實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)及臨床醫(yī)學(xué)研究方面有著重要的意義。聚合酶鏈反應(yīng)為這些技術(shù)提供了大量的純DNA，有時(shí)是單鏈的。珠海實(shí)時(shí)Real-time PCR原理及步驟

Real-time PCR鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。外源DNA污染。確保操作的潔凈。陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶：試劑，頭，工作臺(tái)污染。使用全新的試劑和頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。條帶大小與理論不符：污染。使用全新的試劑和頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。模板或引物使用錯(cuò)誤。更換引物和模板?；騺喰?。對(duì)研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)較廣用于表達(dá)譜，以確定基因的表達(dá)或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列。廈門特殊樣本熒光定量PCR研究方案Real-time PCR可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制。

Real-time PCR螢光染料摻入法:在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射螢光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何螢光信號(hào)，從而保證螢光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。此方法適用于：1、靈敏度高：使用SYBR可使螢光效果增強(qiáng)到1000倍以上。2、通用性好,不需要設(shè)計(jì)探針,方法簡(jiǎn)便,省時(shí),價(jià)格低廉。3、通用型方法，在國(guó)內(nèi)外科研中普遍使用。4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測(cè)。5、專一性要求不高的定量PCR檢測(cè)。

所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，之后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過程。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè)。

Real-time PCR的染料法和探針法的選擇：進(jìn)行mRNA表達(dá)量的測(cè)定，采用染料法是比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產(chǎn)物特異性的情況；目的基因和內(nèi)參基因分管檢測(cè)，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針法主要應(yīng)用于病毒RNA的檢測(cè)；以及單位點(diǎn)突變（SNP）；多基因的合并檢測(cè)，探針法還可用于同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)目的基因和內(nèi)參基因的情況；而染料法則必須分管檢測(cè)。Real-time PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡(jiǎn)稱Real-time PCR）是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，之后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法。Real-time PCR探針法適用于擴(kuò)增序列專一的體系的檢測(cè)。寧波骨頭定量PCR設(shè)計(jì)公司

Real-time PCR探針法實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定重複性好，特異性更高。珠海實(shí)時(shí)Real-time PCR原理及步驟

Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析：定性分析指的是用于分析待檢測(cè)的樣本中是否存在我們想要檢測(cè)的成分，即待檢測(cè)成分有無的分析。通常，定性分析可以應(yīng)用于病毒以及病原菌的檢測(cè)，物種鑒定以及基因分型等。病毒及病原菌檢測(cè)，如SARS、H1N1病毒，都可以通過Real-time PCR的方法進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)，定性分析樣本是否已被病毒傳播。物種鑒定如我們國(guó)家的一些檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)，想要檢測(cè)進(jìn)口的牛肉制品中是否含有雞源、豬源或鴨源等成分，或者用于檢測(cè)羊奶中是否會(huì)摻有牛奶等等，可以通過Real-time PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)。基因分型，如啤酒型，肥胖型基因的檢測(cè)，就是Real-time PCR在基因分型方面的應(yīng)用。珠海實(shí)時(shí)Real-time PCR原理及步驟

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