杭州分子生物學數(shù)字PCR應用

Real-time PCR螢光染料摻入法:在PCR反應體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。此方法適用于：1、靈敏度高：使用SYBR可使螢光效果增強到1000倍以上。2、通用性好,不需要設計探針,方法簡便,省時,價格低廉。3、通用型方法，在國內(nèi)外科研中普遍使用。4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測。5、專一性要求不高的定量PCR檢測。實時熒光定量PCR以熒光化學物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。杭州分子生物學數(shù)字PCR應用

聚合酶鏈式反應生物學研究的歷史中占據(jù)了重要的地位。以此為基礎發(fā)展出包括Real-time PCR在內(nèi)的多項應用技術。自誕生后Real-time PCR技術持續(xù)發(fā)展，從簡單的增擴到整個PCR過程，Real-time PCR表現(xiàn)出比PCR更敏感、更明確的定量分析特性和對識別等位基因的能力。不少人以為real-time就是意味著可以在顯示器上看到每個循環(huán)增擴曲線的增長。事實并非如此，早期的軟件不能在運行期間提供可視化的增擴曲線。主要是因為SDS軟件采用整個平臺較終的數(shù)據(jù)執(zhí)行數(shù)據(jù)分析工作，而不是分析每個單獨的反應循環(huán)。對某些設備來說，必須向分析軟件提供實時的數(shù)據(jù)，有些設備則不需要。前一種設備允許軟件實時跟蹤每個加樣口的增擴曲線，同時顯示在電腦屏幕上。武漢微量數(shù)字PCR設計公司實時熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質(zhì)測聚合酶鏈式反應循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。

Real-time PCR探針法適用于：1、具有高適應性和可靠性，實驗結果穩(wěn)定重複性好，特異性更高。2、適用于擴增序列專一的體系的檢測。3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣較佳化引物設計條件都不能解決。5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴增，對特異性要求較高的定量。6、普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產(chǎn)品的檢驗檢疫,生物製品的鑒定。Real-time PCR探針法:PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的螢光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現(xiàn)了螢光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

聚合酶鏈式反應準備：PCR引物設計，PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。引物設計的基本原則：引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC很好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。聚合酶鏈式反應中的DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結構。

Real-time PCR鏈反應注意事項：在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照；內(nèi)參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數(shù)量有關。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應的循環(huán)數(shù)，均應通過單獨實驗來確定；防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA；在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。重疊延伸聚合酶鏈反應可以將缺失、插入或點突變引入DNA序列。杭州分子生物學數(shù)字PCR應用

聚合酶鏈式反應中兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。杭州分子生物學數(shù)字PCR應用

Real-time PCR式反應準備：10×擴增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）、引物（終濃度）、模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg2+（終濃度）、補加雙蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實驗調(diào)整，以上表格只提供大致參考值。PCR反應五要素：參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細胞內(nèi)DNA復制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。引物有多種設計方法，由PCR在實驗中的目的決定，但基本原則相同。杭州分子生物學數(shù)字PCR應用

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