徐州特殊樣本數(shù)字PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：陽(yáng)性對(duì)照：在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高（100個(gè)拷貝以下）。但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照：每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括：標(biāo)本對(duì)照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。試劑對(duì)照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。為了很大限度地減少污染的可能性，調(diào)查人員應(yīng)該為試劑制備、聚合酶鏈反應(yīng)和產(chǎn)品分析預(yù)留單獨(dú)的房間。徐州特殊樣本數(shù)字PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；堿基配對(duì)原則；Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。珠海骨頭熒光PCR技術(shù)服務(wù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR所用的酶主要有兩種來(lái)源：Taq和Pfu，分別來(lái)自?xún)煞N不同的噬熱菌。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物3‘端的堿基，特別是很末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：MgCl2濃度過(guò)高?？蛇m當(dāng)降低其用量。模板量過(guò)多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50 ng，而基因組DNA則應(yīng)<200 ng。引物濃度不夠優(yōu)化。對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。循環(huán)次數(shù)過(guò)多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時(shí)間及延伸時(shí)間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。退火溫度過(guò)低。電泳體系有問(wèn)題：凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；凝膠沒(méi)有凝固好；瓊脂糖質(zhì)量差。若為PCR試劑盒則可能：由于運(yùn)輸儲(chǔ)存不當(dāng)引起試劑盒失效；試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，然后通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。循環(huán)的次數(shù)過(guò)多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。 樣品處理不當(dāng)。Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題。復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。PCR的另一個(gè)限制是，即使是很少量的污染DNA也可以被擴(kuò)增，導(dǎo)致誤導(dǎo)或模糊的結(jié)果。南通實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)技術(shù)服務(wù)

熱啟動(dòng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：一種在PCR的初始建立階段減少非特異性擴(kuò)增的技術(shù)。徐州特殊樣本數(shù)字PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。徐州特殊樣本數(shù)字PCR