北京FabRICATOR ZIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

來源: 發(fā)布時(shí)間:2024-07-02

對(duì)于涉及完整Fab或Fc抗體片段的應(yīng)用,需要在抗體鉸鏈處進(jìn)行消化。木瓜蛋白酶和 Lys-C 等傳統(tǒng)酶可用于生成 Fab 片段,但非特異性酶活性需要仔細(xì)優(yōu)化,以極大限度地降低多個(gè)消化位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。Genovis的SmartEnzymes IgG 蛋白酶 GingisKHAN 和 FabALACTICA 具有一個(gè)消化位點(diǎn),可從人 IgG1 生成均質(zhì)的 Fab 和 Fc 抗體片段。生成的片段可用于結(jié)晶和高階結(jié)構(gòu) (HOS) 的 NMR 研究、結(jié)合研究等。在這里,我們提出了獲得完整Fab和Fc抗體片段的不同策略。所得片段顯示 GingisKHAN 的有效消化,用于生成完整的 Fab 片段或從依那西普上的融合 TNFR 結(jié)構(gòu)域中分離 Fc。由于 GingisKHAN 的特異性消化依賴于 IgG 的天然折疊,因此在變性條件下特異性受到負(fù)面影響。為了使用SDS-PAGE分析消解效率,在加入SDS上樣緩沖液之前,停止在分析樣品中加入碘乙酰胺的反應(yīng)。Genovis同時(shí)提供IdeS酶的純化試劑盒。使用GlySERIAS固定化消化融合蛋白得到均質(zhì)Fc/2。北京FabRICATOR ZIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

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與IdeS不同,度拉糖肽由兩個(gè)胰高xue糖素樣肽-1 (GLP-1) 分子組成,它們通過柔性 GS 接頭連接到人 IgG4 的 Fc 區(qū)域。為了分別研究肽和 Fc 區(qū)域,從而鑒定結(jié)構(gòu)域特異性 PTM,用 Genovis的GlySERIAS 在 37°C 下凍干消化度拉糖肽 1 小時(shí)。為了降低樣品復(fù)雜性,使用內(nèi)切糖苷酶GlycINATOR Lyophilized去除Fc聚糖,并用DTT還原鏈間二硫鍵。反相LC-MS對(duì)樣品的分析表明,使用GlySERIAS進(jìn)行連接子消化后,肽從Fc區(qū)域完全去除。連接子中的大量甘氨酸殘基為GlySERIAS提供了許多不同的潛在消化位點(diǎn),這就是為什么Fc/2和GLP-1肽都被檢測(cè)為幾種變體,其中不同數(shù)量的甘氨酸和絲氨酸殘基仍然連接。此外,還鑒定了GLP-1肽的氧化。盡管GlySERIAS同時(shí)在多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行消化,但一式三份的酶解在獲得的不同F(xiàn)c/2變體的相對(duì)量中顯示出可重復(fù)的結(jié)果。廣東IgGZEROIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶Genovis的IdeS蛋白酶是IgG特異性半胱氨酸蛋白酶。

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IgA 消化酶的 IgASAP 家族特異性消化血清和分泌型人 IgA 以生成 Fab 和 Fc 片段。IgASAP Sub1 特異性消化人 IgA1,而 IgASAP Sub1+2 同時(shí)消化人 IgA1 和 IgA2m1。 Sub1+2 特異性消化鉸鏈上方的 IgA1 和 IgA2m1。兩種酶都產(chǎn)生完整且均質(zhì)的 Fab 和 Fc 片段。為了獲得純和完整的Fab片段,使用Genovis的GingisKHAN Fab Kit進(jìn)行人IgG1的消化和抗體片段的后續(xù)純化。通過與 GingisKHAN 孵育,然后在 CaptureSelect? 人 CH1 離心柱上親和純化,在曲妥珠單抗上證明了完整的片段生成。樣品的酶和Fc部分存在于色譜柱的流通中,F(xiàn)ab很容易通過降低pH洗脫。使用該試劑盒,可以制備 0.5 mg 至 2 mg 人 IgG1 的 Fab 片段。Genovis同時(shí)提供IdeS酶的純化試劑盒。

Genovis的FabRICATOR是一種半胱氨酸蛋白酶,它對(duì)許多不同的物種和IgG亞類都有活性,包括人IgG亞類1-4以及猴子、兔子、大鼠和綿羊IgG的一些亞類。FabRICATOR在鉸鏈下方的單個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行消化,生成F(ab’)2和Fc/2子基,可以進(jìn)一步還原生成Fd’,輕鏈和F/2子基是必需的。FabRICATOR(IdeS)通過蛋白-蛋白相互作用與目標(biāo)抗體工作,這說明了它的高特異性。事實(shí)上,它在單個(gè)位點(diǎn)消化意味著使用FabRICATOR時(shí)沒有過度消化的風(fēng)險(xiǎn),其高特異性也意味著相同的消化方案可以作為平臺(tái)方法應(yīng)用于許多不同的抗體。FabRICATOR(IdeS)不需要還原條件來獲得良好活性,也不需要任何額外的輔助因子,它將在不同生理緩沖中發(fā)揮作用。這意味著按照下面的鉸鏈消解,您將生成F(ab’)2和Fc/2片段用于分析或其他應(yīng)用。Genovis 酶產(chǎn)品,被世界各地的科學(xué)家使用,創(chuàng)新的產(chǎn)品形式促進(jìn)了生物藥物的開發(fā)和質(zhì)量控制。

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與IdeS不同,Genovis的GlySERIAS是一種獨(dú)特的酶,可消化柔性富含甘氨酸的融合蛋白連接子,例如Gly4Ser和GlyxSery(GS)以及聚甘氨酸(G)接頭。該酶能夠分離多功能融合蛋白的各個(gè)結(jié)構(gòu)域,以促進(jìn)表征并增加對(duì)這些分子的理解。融合蛋白的中級(jí)分析既可以降低整體樣品的復(fù)雜性,又可以對(duì)翻譯后修飾進(jìn)行結(jié)構(gòu)域特異性鑒定和監(jiān)測(cè)。為了改善連接子的去除,Genovis建議使用GlySERIASImmobilized。對(duì)于連接子表征,我們推薦GlySERIAS凍干。具有柔性接頭的獨(dú)特酶消化融合蛋白;中級(jí)方法可降低融合蛋白表征的復(fù)雜性;復(fù)雜融合蛋白的可靠且可重復(fù)的消化。Genovis的GlySERIAS酶切由甘氨酸或甘氨酸和絲氨酸殘基的重復(fù)序列組成的柔性連接子。該酶在天然反應(yīng)條件下具有活性,能夠?qū)?fù)雜的融合蛋白進(jìn)行中級(jí)表征。連接子區(qū)域同時(shí)在多個(gè)位點(diǎn)被消化,導(dǎo)致先前連接的組分分離?;钚园l(fā)生在pH7.6下,孵育時(shí)間可以根據(jù)所需的產(chǎn)物而變化。GlySERIAS是從噬菌體K克隆而來的,在大腸桿菌中表達(dá)。該酶含有His標(biāo)簽,分子量為18kDa。為了分別研究度拉糖肽的肽和 Fc 區(qū)域,用GlySERIAS 在 37°C 下凍干消化1 小時(shí)。湖南FabDELLOIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

可用于研究特定Fc區(qū)域的質(zhì)量屬性,有助于研究GS連接子的修飾。北京FabRICATOR ZIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

用于IgA1和IgA2m1以上鉸鏈消化的凍干酶。與IdeS不同,Genovis提供的IgASAPSub1+2在鉸鏈上方的一個(gè)特定位點(diǎn)消化人IgA1和IgA2m1,產(chǎn)生完整且均勻的Fab和Fc片段。由于人IgA1的鉸鏈比IgA2的鉸鏈長,因此IgA1和IgA2m1之間來自消化位點(diǎn)的氨基酸C末端不同。IgASAPSub1+2可消化分泌物和血清IgA。孵育時(shí)間為過夜(16-18小時(shí)),并且由于酶的特異性,沒有過度消化的風(fēng)險(xiǎn)。該酶在pH值為6.0至8.0時(shí)具有活性,不需要還原條件或輔助因子即可產(chǎn)生活性?;钚詾?7°C。IgASAPSub1+2是從丹毒梭菌克隆而來的,并在大腸桿菌中表達(dá)。該酶含有His標(biāo)簽,分子量為131kDa。IgASAPSub1+2凍干劑以凍干粉的形式提供,裝在1000個(gè)單位的小瓶中,用于消化1mgIgA1和IgA2m1。北京FabRICATOR ZIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)