河南凍干粉形式PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究

為了證明Genovis的PNGase F凍干和PNGase F固定在各種底物上的去糖基化能力，用PNGase F凍干或PNGase F固定化處理了一系列糖蛋白。使用天然反應(yīng)條件在一小時(shí)內(nèi)有效去除曲妥珠單抗和依那西普上的所有N-糖，以及西妥昔單抗上的Fc-糖。當(dāng)加入RapiGest?并在變性條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，西妥昔單抗的所有N-聚糖（包括Fab-聚糖）在PNGase F固定化10分鐘內(nèi)完全去除，PNGase F固定化15分鐘內(nèi)完全去除。在變性反應(yīng)條件下，PNGase F 在 30 分鐘內(nèi)成功將更復(fù)雜的 F 融合蛋白阿巴西普和阿柏西普去糖基化。使用變性和還原反應(yīng)條件，將常用的糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品RNase B在10或15分鐘內(nèi)完全去糖基化，分別使用PNGase F凍干或PNGase F固定化。在天然和變性條件下生成的去糖基化樣品與LC-MS分析兼容。Genovis測試了 SialEXO 凍干和 SialEXO 固定化在人 C1 抑制劑上的性能。河南凍干粉形式PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究

Genovis的ImpaRATOR? 可用于多種 O-聚糖：依那西普是一種融合蛋白，由TNF受體的胞外結(jié)構(gòu)域與人IgG1的Fc部分相連。該蛋白質(zhì)在Fc區(qū)域上方含有多達(dá)13個(gè)O-糖基化的Ser/Thr殘基簇，使其成為一種非常難以在結(jié)構(gòu)上表征的生物制藥。為了證明ImpaRATOR的聚糖特異性，制備了三種具有不同聚糖組成的依那西普樣品：（i）攜帶單唾液酸和二唾液酸化he心1結(jié)構(gòu)混合物的未經(jīng)處理的糖蛋白，（ii）用SialEXO處理的糖蛋白去除唾液酸并產(chǎn)生裸核1結(jié)構(gòu)，以及（iii）用SialEXO和GalactEXO處理的糖蛋白產(chǎn)生單個(gè)GalNAc殘基， 也稱為Tn抗原。用ImpaRATOR和FabRICATOR在一鍋反應(yīng)中處理三個(gè)樣品（圖1）。作為比較，SialEXO處理的依那西普用OpeRATOR和FabRICATOR處理。將所得肽還原、烷基化并用HILIC-MS進(jìn)行分析。FabRICATOR被包括在反應(yīng)中，以將Fc區(qū)與大多數(shù)C端糖肽分離，以促進(jìn)其表征。陜西N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶生物藥物開發(fā)依那西普是一種 Fc 融合蛋白，具有高度 O-糖基化的鉸鏈區(qū)域。

用于糖蛋白去唾液酸化的凍干酶混合物。Genovis的SialEXO 凍干劑以凍干粉的形式提供，裝在 2000 個(gè)單位的小瓶中，用于 2 mg 糖蛋白的去唾液酸化。1. 用于方法開發(fā)的靈活格式；2. 可以結(jié)合酶以提高效率；3. 適用于自動(dòng)化工作流程；4. 即用型 - 只需加水即可。用于水解ɑ2-3-連接唾液酸的凍干酶。 Genovis的SialEXO 2-3凍干劑以凍干粉末的形式提供，裝在500個(gè)單位的小瓶中，用于0.5mg糖蛋白的去唾液酸化。 與唾液酸酶混合物 SialEXO 相比，SialEXO 2-3 是一種 α2-3 特異性唾液酸酶，允許對(duì) α2-3 連接的唾液酸進(jìn)行靶向分析。O-和N-糖基化蛋白的高效α2-3去唾液酸化可以在1小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)。

genvois的OpeRATOR 是一種內(nèi)切蛋白酶，可催化直接靠近 O-聚糖的天然粘蛋白型 O-糖基化蛋白的肽鍵的水解。內(nèi)切蛋白酶具有高特異性，可消化絲氨酸或蘇氨酸殘基的O-聚糖N端的蛋白質(zhì)。 OpeRATOR 活性需要粘蛋白型的 O-聚糖，并且該酶不會(huì)用 N-連接聚糖消化糖蛋白。該酶對(duì)具有亞洲化he心1 O-聚糖的位點(diǎn)z活躍。它還消化唾液酸化的he心 1 和he心 3，但程度要低得多。為了獲得z佳性能，需要去除唾液酸，因此，SialEXO凍干（唾液酸酶混合物）包含在購買中。 上海倍篤生物涵蓋藥物研發(fā)的全流程，抗體結(jié)構(gòu)域分析蛋白酶、蛋白聚糖分析水解酶等。

GalactEXO中的酶來源于Akkermansia muciniphila，并在大腸桿菌中表達(dá)。GalactEXO由兩種半乳糖苷酶組成，均帶有His標(biāo)簽，組分的分子量為87 kDa和109 kDa。用于水解糖蛋白上β1-3,4-連接半乳糖的凍干酶。Genovis的GalactEXO 凍干劑以凍干粉的形式提供，裝在 2000 單位小瓶中，用于在 2 mg 糖蛋白上水解 β1-3,4-連接的半乳糖。1. 用于方法開發(fā)的靈活格式；2. 可以結(jié)合酶以提高效率； 3. 適用于自動(dòng)化工作流程；4. 即用型 - 只需加水即可！將混合物加載到GlycOCATCH上，洗滌樹脂，并用8M尿素洗脫結(jié)合的肽。純化后，在RP-LC-MS上分離樣品。數(shù)據(jù)顯示，糖苷酸肽的選擇性純化，攜帶he心1-O-聚糖。IgA 特異性 O-糖肽富集：IgA 抗體包含 N-連接的糖基化和重度 O-糖基化的鉸鏈區(qū)域。胰蛋白酶消化IgA后，將肽和genovis 的SialEXO的混合物加載到GlycOCATCH樹脂上，并用PBS和離心洗滌。用 8 M 尿素洗脫顯示預(yù)期的 O-糖基化鉸鏈肽富集，具有不同程度的糖基化。用于糖蛋白去唾液酸化的凍干酶混合物SialEXO 凍干劑以凍干粉的形式提供，裝在 2000 個(gè)單位的小瓶中。北京瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶生物藥物開發(fā)

SialEXO凍干由兩種唾液酸酶組成，每種唾液酸酶都具有獨(dú)特的活性，并且它們同時(shí)起作用。河南凍干粉形式PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究

GlycOCATCH用于純化粘蛋白型O-糖基化蛋白和肽。它是基于無活性的Genovis的OpeRATOR?酶，該酶經(jīng)過工程改造，可以高親和力結(jié)合O-糖基化蛋白和肽。GlycOCATCH的應(yīng)用包括O糖蛋白和肽的特異性富集或去除、糖組學(xué)、復(fù)雜樣品的研究和生物制藥的表征。1. 粘蛋白型O-糖基化蛋白和肽的特異性富集；2. 可靠 - 高親和力結(jié)合;3. 快速且易于使用的工作流程。不需要輔助因子或特殊緩沖液。GalNAcEXO中的酶來源于Akkermansia muciniphila，在大腸桿菌中表達(dá)，帶有His標(biāo)簽，分子量為52 kDa。1. 用于方法開發(fā)的靈活格式；2. 可以結(jié)合酶以提高效率；3. 適用于自動(dòng)化工作流程； 4. 即用型 - 只需加水即可！用于水解糖蛋白上GalNAc殘基的凍干酶。Genovis的GalNAcEXO凍干劑以凍干粉末的形式提供，裝在2000單位的小瓶中，用于水解2mg糖蛋白上的GalNAc殘基。河南凍干粉形式PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究